薯蓣皂苷元对膀胱肿瘤细胞的抑制作用的研究

发布时间：2020-06-25 13:46

【摘要】：背景:膀耽癌是泌尿外科的常见恶性肿瘤之一,发病率为十大恶性肿瘤其中之一,膀胱癌在中国的发病率排在尿路恶性肿瘤的第一位。膀胱癌分为非肌肉浸润性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC),约75%至85%的新发现的膀胱癌是非肌肉浸润性膀胱癌。经尿道切除膀胱(TURBT)是NMIBC的主要诊断和治疗方式,同时可获得准确的病理分期和分级。虽然TURBT可以有效去除肿瘤组织,但膀胱癌仍然存在高复发率。只有TURBT不通过膀胱灌洗补充治疗膀胱癌,约45%的患者在1年内复发。手术结合膀胱灌注治疗可有效杀死残余肿瘤,降低膀胱癌复发率。大多数膀胱内灌注药物如卡介苗(BCG),表柔比星,吡柔比星等用于术后预防肿瘤复发。这些药物通常昂贵并且可引起严重的并发症,例如尿频,尿急,排尿困难等,血尿和免疫抑制等。因此,有必要找到一种有效但副作用较小的药物来杀死膀胱肿瘤细胞。薯蓣皂苷元,通常称为皂苷,是天然合成甾族皂苷,具有C27 H4203结构式,分子量为414.63的甾醇糖苷配基(图1 A),其广泛存在于豆科植物和山药科植物中。薯蓣皂苷元的主要来源是葫芦巴的种子,也可以通过水杨酸,发酵,萃取等方法从盾叶薯蓣、穿龙薯蓣、黄山药、紫黄姜等植物的块茎中提取获得。作为用于合成类固醇激素和留体避孕药的重要原料,薯蓣皂苷配基通常用于生产药物,例如孕烯醇酮,孕酮和可的松。在过去几十年中,关于薯蓣皂苷元的研究越来越受到人们的重视。薯蓣皂苷元在多种肿瘤有明显的抑制作用,然而其对膀胱肿瘤的抑制作用及机理仍不明确,本研究即从该角度出发,探究薯蓣皂苷元对膀胱肿瘤细胞的抑制作用及机制。目的:众多的研究结果表明,薯蓣皂苷元可以在多种癌细胞中产生作用,包括乳腺癌细胞、结肠癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、成骨肉瘤细胞等均有细胞毒性,其主要作用机制表现为:抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、阻断细胞周期和抗肿瘤转移等多种方式发挥抗肿瘤作用。然而其对膀胱肿瘤的抑制作用及机理目前尚不明确,本研究的目的旨在探究薯蓣皂苷元对膀胱肿瘤细胞的抑制作用及机制。具体如下:(1)在细胞层面探究薯蓣皂苷元对膀胱癌细胞(T24和5637)生长的抑制作用,明确量效关系。(2)明确薯蓣皂苷元对膀胱肿瘤细胞周期及凋亡的影响,并进一步验证凋亡及周期相关基因及蛋白变化。(3)明确薯蓣皂苷元对膀肮肿瘤细胞迁移诱导的影响,并确定相关蛋白的表达状况。(4)为临床应用薯蓣皂苷元治疗膀胱肿瘤提供科学的实验依据。方法:(1)应用MTT法测定不同浓度(0,10,20,30,40,50,60微克/ml)的薯蓣皂苷元作用不同时间(24h,48h,72h)对膀胱肿瘤细胞系(T24及5637)的生长抑制作用;(2)流式细胞仪(FCM)采用PI染色检测不同浓度的薯蓣皂苷元对膀胱肿瘤细胞株细胞周期分布的影响。(3)采用Annexin V/PI凋亡试剂盒通过FCM分析检测薯蓣皂苷元对膀胱肿瘤细胞凋亡的影响情况,观察是否具有浓度依赖性。(4)应用Transwell及细胞划痕实验检测薯蓣皂苷元作用膀胱肿瘤细胞后细胞迁移能力的变化(5)应用PCR和Westen-blot分析药物对细胞基因组及蛋白组的影响。结果:(1)MTT实验结果显示,不同浓度薯蓣皂苷元(0,10,20,30,40,50及60微克/mL)处理膀胱癌细胞株5637和T24细胞,薯蓣皂苷元能够抑制膀癌T24和5637细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性。(2)利用PCR在不同浓度及不同时间薯蓣皂苷元抑制T24及5637细胞中来检测Bcl,Bax,Caspase-3等的表达。结果显示,随着薯蓣皂苷元浓度的增加及处理时间的延长,在T24及5637细胞中相关mRNA的表达有明显的变化趋势。这些结果表明,薯蓣皂苷元对相关基因的表达具有浓度依赖性和时间依赖性。(3)通过流式细胞仪技术,薯蓣皂苷元处理的膀胱肿瘤细胞停滞分裂在GO/G1期,与未处理的细胞相比,随着薯蓣皂苷元浓度的增加,停滞在GO/G1期的肿瘤细胞逐渐增多,并且具有浓度依赖性。(4)我们通过对膀胱癌细胞进行annexin V和PI双染,流式结果显示薯蓣皂苷元可以诱导膀胱癌细胞株T24及5637细胞的早期和晚期的凋亡,并且有浓度依赖性。(5)Transwell实验及划痕实验的结果表明,薯蓣皂苷元可以降低膀胱肿瘤细胞T24及5637的迁移能力,与对照组相比较,穿过transwell小室的细胞数目及细胞迁移率明显减少。(6)Westernblot结果显示,通过逐渐增加的浓度及时间处理,在T24细胞中Bcl-2,Caspase-3,Vimentin等蛋白的表达有明显的逐渐减低趋势,Bax等蛋白的表达逐渐增加,并具有时间和浓度依赖性。结论:以上结果表明薯蓣皂苷元能够通过调节凋亡相关基因Bcl-2,周期相关基因CDK2/4/6,CyclinD1,迁移相关基因N-cadherin,Vimentin等的表达,阻滞GO/G I细胞周期,诱导的细胞凋亡,阻止细胞迁移,从而抑制膀胱癌T24及5637细胞的增殖和侵袭效应,同时更有效的杀伤膀胱肿瘤细胞。因此,通过薯蓣皂苷元干预的肿瘤细胞其生长活性明显受抑制,薯蓣皂苷元将来可作为一种新的膀胱癌的术后用药的可能。
【学位授予单位】：武汉大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：

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本文编号：2729227