基于Cas9基因修饰技术构建EpCAM调控糖脂代谢小鼠模型及鉴定

发布时间：2020-06-26 04:42

【摘要】：研究背景:糖脂代谢病是由糖代谢紊乱和脂代谢紊乱引起的一系列疾病的总称,肝脏是调节机体糖脂代谢的重要器官,目前大多数对糖脂代谢病的研究主要在肝脏开展。从中医的角度来讲“肝”在机体生命活动中主要起“枢纽”平衡作用,能够协调其它脏腑功能的顺利进行。现代发育生物学研究发现肝脏与肠道是同源的,二者在调控代谢方面均有重要作用。中医药在治疗糖脂代谢紊乱有着多层次、多靶点的特点。上皮细胞连接分子EpCAM已被证实对胚胎干细胞多能性的维持具有重要意义,在肝脏干细胞等多种成体干细胞中发挥着重要作用,在小鼠胚胎期肝干细胞中高表达,在成熟的肝细胞中低表达或不表达,而且在由肝纤维化、肝硬化、肝癌等肝损伤引起的肝脏疾病的肝细胞中异常表达。当EpCAM缺失,人和小鼠的肠道均发生先天性簇绒肠病;在前期研究中发现EpCAM打靶伴随小鼠肠道紧密连接结构改变,而这一改变会严重影响肠道功能,进而对肝功能产生影响,但EpCAM对糖脂代谢的具体调控机制目前尚不清楚。CRISPR/Cas技术作为一种最新涌现的基因组编辑工具,能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞,是目前最高效的基因组编辑系统。运用最新基因编辑技术CRISPR/Cas9获得稳定遗传的EpCAM基因敲除小鼠,对该基因敲除模型小鼠进行研究以探索EpCAM干预糖脂代谢病的功能,并在中医药理论指导下研究其机理。目的:1、运用CRISPR/Cas9技术,体外构建载体结合电转染注射、胚胎移植、小鼠传代等获得稳定遗传的EpCAM基因敲除小鼠。2、对制作出的EpCAM基因敲除小鼠的基因敲除效果进行验证。3、研究EpCAM基因缺失对肠道分化能力的影响,进而探讨对糖脂代谢的调控机制。方法:1、EpCAM基因敲除小鼠的制作:体外构建Cas9 mRNA及gRNA载体,通过电转染注射与胚胎移植获得F0代小鼠并对其鉴定基因型,选取杂合基因型小鼠与C57BL/6小鼠杂交得到F1代小鼠,鉴定其具体序列。选取敲除序列完全一致的雌雄鼠自交继而繁殖得到F2代小鼠,选取遗传性状稳定的杂合F2代小鼠进行繁育保种,并从中选取基因敲除纯合子小鼠进行分析。2、EpCAM基因敲除小鼠打靶效果及表型检测:对EpCAM基因敲除小鼠做表型分析,肠道形态学和组织化学分析,随后对肠道紧密连接分子做Real-time PCR检测,并结合免疫组化检测分析。3、EpCAM基因敲除后小鼠肠细胞分化能力研究:对EpCAM基因敲除小鼠肠道组织分化细胞关键marker做Real-time PCR检测,并结合免疫组化检测分析其表达变化情况。结果:1.运用CRISPR/Cas9技术成功制作出EpCAM基因敲除小鼠模型并通过一系列基因鉴定确定正确敲除,同时留取杂合基因型小鼠使遗传性状稳定地保种繁育。2.对EpCAM基因敲除小鼠肠道检测发现表型明显改变且各相关连接分子表达出现紊乱,肠细胞分化因子等相关基因发生改变。结论:首次采用CRISPR/Cas9基因编辑技术制作出EpCAM基因敲除小鼠模型,进一步研究EpCAM基因在小鼠体内的功能,同时探明EpCAM可能通过调控肠细胞分化能力实现对糖脂代谢的调控。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5;R-332
【图文】：

琼脂糖电泳,碱基序列,测序,体外转录

（1）设计出的 Cas9 gRNA 碱基序列：EpCAM-Cas9-gRNA-F: 5’-ATA GGGCGATCCAGAACAEpCAM-Cas9-gRNA-R: 5’-TAAAAC ATCGTTGTTCTGG（2）PCR 扩增靶点引物序列：EpCAM-F: CTTGGCCTGGATGGCAGCAGAATAAEpCAM-R: TCACTCACTAGGTCCTCACGCGCTC（3）EpCAM-Cas9 gRNA 碱基序列测序结果：Cas9 gRNA 碱基序列测序结果与原序列致，说明所构建的。体外转录用 gRNA 载体图谱 Cas9 markergRNA

模板,电泳图,载体,琼脂糖电泳

图 2-2 (a)Cas9 载体模板酶切验证电泳图；(b)CaFig 2-2 (a)Enzymatic digestion of Cas9 vector template vermRNA agarose gel electrophero对照组比载体模板片段小些，说明酶切成功，载琼脂糖凝胶成像有亮带，说明 Cas9 mRNA 成功制2.5 本章小结该部分通过设计并合成 Cas9 gRNA 碱基序列，过碱基序列测序，测得序列与原序列致，说明所构同时用限制性内切酶酶切质粒载体，使其线性化，载体模板酶切成功即变为线性化模板，成功制取 CgRNA 和 Cas9 mRNA 可用作下步的受精卵电转

【参考文献】