可促进rAAV转导的中药成分筛选及其机制研究

发布时间：2020-06-26 05:35

【摘要】：腺相关病毒(Adeno-Associated virus,AAV)是没有致病性的,无包膜的微小病毒科的一员,由于其自身存在复制缺陷,因此只能在辅助病毒存在的条件下才能够完成自身的复制周期。重组线相关病毒基因治疗(recombinant adenoassociated virus,rAAV)载体在目前基因治疗中是最常用的、极具前景的载体之一。目前rAAV已经用于血友病、先天性黑朦、帕金森病、心力衰竭等多项基因治疗的临床研究中。与其他基因治疗载体相比,rAAV具有高安全性、稳定性,低致病性、免疫原性,宿主范围广范以及长期表达等优点。全球第一个基因治疗药物正是基于rAAV1。然而,rAAV在宿主内有限的转导效率,导致了基因治疗成本过高,而且高剂量的rAAV会引起机体发生免疫反应。细胞应激通路是激发多种潜伏病毒生命周期的关键。已有文献报道,细胞的应激反应往往能够引起rAAV载体的转导,甚至有些应激源能够代替辅助病毒的作用。考虑到中药活性成分安全、副作用小、病人服用顺应性好等优势,我们选择从中药中筛选具有活性的单体成分作为应激源来进行研究。目前已经有中药单体成分以蛋白酶抑制剂的角色成为促进rAAV转导药物中的一员,如雷公藤红素、扁素藤素等。丹参(Salvia miltiorrhiza bunge)是我国一类传统中药,有着悠久的历史。文献报道,丹参中的活性成分能够影响乙肝病毒(HBV)、艾滋病毒(HIV)等病毒的生活周期,因此,本课题将主要从丹参类药物中筛选能够促进rAAV转导的天然药物活性成分。本文整合体外转导实验和免疫荧光实验建立了一套完整的中药活性成分筛选与靶标筛选的研究策略,以丹参为主要药物进行研究。首先,我们成功制备了可以用于后续实验的多种类型的rAAV载体,以保证实验的顺利进行。其次,我们在前人实验的基础上改进了实验方法与策略,成功地从丹参中筛选出丹酚酸B(salvianolic acid B,Sal B)和丹参素两个活性成分。然后通过细胞活力、药效关系、时效关系、稳定性探究和普适性等实验对Sal B进行了活性验证。结果证明,Sal B确实能够提高rAAV在HEK293细胞中的转导效率,该作用在多种类型细胞系中均适用。所以,我们采用免疫荧光技术来标记rAAV载体颗粒,观察其在细胞内的分布以明确Sal B的作用靶点。实验证实晚期内涵体是Sal B的作用靶点。综上所述,通过以上策略,我们成功地从丹参中筛选出两个活性成分,并且通过细胞成像技术筛选得到了Sal B的作用靶点,阐明了Sal B提高rAAV转导效率的作用机制。
【学位授予单位】：华侨大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284
【图文】：

结构示意图,技术通报

AAV结构示意图

细胞的,宿主细胞,腺病毒,辅助病毒

1.1.2 AAV 的生活周期AAV 的感染方式分为潜伏性感染和裂解性感染。AAV 担负感染宿主时，由于没有辅助病毒的辅助 AAV 病毒基因组在整合到宿主细胞染色体后，随着宿主自身的复制而复制。在潜伏性感染中，AAV 进入细胞核后开始进行脱衣壳的环节，调节蛋白质，使其发生有限的表达，进而抑制这种病毒基因的更进一步表达以及其的复制，这一过程就是病毒在细胞内建立的潜伏性感染。AAV 的裂解性感染往往伴随着辅助病毒共感染宿主细胞的发生而发生。以腺病毒为例，发生共感染时，腺病毒提供 E1a、E1b、E2a、E4 和 VA RNA 等基因来辅助 AAV 的感染，但不提供与腺病毒 DNA 复制直接相关的 E2b 基因。这种辅助功能也在一定程度上反映了腺病毒感染对宿主 DNA 合成机制的影响。病毒感染宿主细胞后的转运过程如下（图 1.2）：

【参考文献】