Nrf2信号通路在枸杞多糖防护UV致HSF细胞急性光损伤的机制

发布时间：2020-06-26 23:08

【摘要】：【研究背景】太阳辐射包含紫外线(Ultraviolet,UV)、可见光及红外线。而UV辐射是最具有生物学效应的部分,对人类的健康及疾病有着最大的影响。阳光中的UV根据生物学作用差异分为三类:长波紫外线(Ultraviolet A,UVA,320㧟400 nm)、中波紫外线(Ultraviolet B,UVB,280㧟320 nm)、短波紫外线(Ultraviolet C,UVC,200㧟280 nm)。由于臭氧层的折射、散射作用,大部分UVB、几乎全部UVC均被吸收,无法到达地球表面。所以生活在地球表面的人类主要受UVA及少量UVB的辐射。皮肤作为我们人体最大的器官,是抵御外界机械、生物、化学、物理等各种刺激的第一道防线。UV是造成皮肤损伤、破坏皮肤屏障的关键性因素;长期、累积或大剂量UV照射可以导致急性日晒伤、慢性光化性皮炎、日光性角化病、多形性日光疹、光老化、皮肤肿瘤等光线性皮肤病。值得关注的是,随着全球臭氧层严重破坏、UV辐射量增加、人类生活方式的改变,UV引起的光线性皮肤病的发病率呈逐年上升的趋势,成为全球关注的热点问题。UV诱导皮肤急性光损伤发生的机制复杂,尚未完全阐明,目前国内外对急性光损伤机制的研究主要集中在细胞凋亡、脂质蛋白质作用、DNA损伤及修复、氧化应激等方面。大量研究证明UV导致氧化应激在皮肤急性光损伤的发生中起了关键性作用。而UV诱导细胞产生过量的超氧阴离子(O2·-)、过氧化氢(H_2O_2)、羟自由基(·OH)、单线态氧(O2)、一氧化氮(NO)等活性氧族(Reactive oxygen species,ROS)是诱发氧化应激损伤的重要环节。而且ROS参与了肿瘤、神经性病变、高血压、糖尿病及心血管等疾病的发生。因此,研究抗氧化应激通路变得迫在眉睫。迄今为止发现的最重要的抗氧化应激通路为核因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-relatedfactor 2,Nrf2)信号通路。当UV辐射产生过量的ROS时,存在于细胞核内的转录因子BTB-CNC异体同源体-1(BTB CNC homology 1,Bach1)和Maf识别元件(Maf recognition elements,MAREs)解离,出核并降解。此时,位于细胞质中Nrf2与其负向调节蛋白Kelch样ECH联合蛋白1(Kelch-like-Ech-associated㧟protein 1,Keap1)解耦联,入细胞核,与MAREs结合形成异二聚体后识别并结合抗氧化反应元件(Antioxidant response element,ARE),调控下游II相解毒酶、抗氧化物酶及抗炎症蛋白等表达,如血红素加氧酶(Heme oxygenase-1,HO-1)、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase,GSH-Px)、醌氧化还原酶1(NAD(P)H:quinone oxidoreductase l,NQO1)、环氧化物水解酶及乙醛还原酶等;清除ROS,减轻氧化应激损伤,维持细胞正常结构与功能。故寻找天然的UV防护剂,激活Nrf2通路,拮抗UV对皮肤的损伤成为国内外研究的新趋势。近年研究发现,从我国传统中药枸杞果实中提取出的枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)具有抗氧化、抗辐射、抗老化等功能,但对枸杞多糖能否通过调节Nrf2通路,发挥强大的抗氧化活性,防护UV致急性光损伤尚不清楚。因此,本研究探讨枸杞多糖对UV致人皮肤成纤维细胞(Human skin fibroblasts,HSF)急性光损伤的防护作用,及对Nrf2信号通路的调控作用,为新型抗皮肤光损伤产品开发提供科学依据。【目的】1.探讨枸杞多糖是否具有防护UVA/UVB致HSF细胞急性光损伤的作用。2.探讨枸杞多糖对UVA/UVB致HSF细胞急性光损伤可能防护的机制。3.探讨枸杞多糖对Nrf2信号通路的调控作用,进一步阐明枸杞多糖防护光损伤作用的机制。【方法】1.采用不同浓度枸杞多糖(100μg/m1、200μg/m1、300μg/m1、400μg/m1、500μg/m1、600μg/m1、1000μg/m1、1500μg/m1、2000μg/m1)孵育体外培养的HSF细胞,用倒置光学显微镜及MTT法检测每组细胞形态变化及增殖情况,筛选出适宜、无毒性的药物浓度。2.采用分光光度计测定枸杞多糖对UVA及UVB的吸收情况。3.采用筛选出的适宜浓度的枸杞多糖处理HSF细胞,24 h后再分别行UVA(25J/cm~2)和UVB(300 mJ/cm~2)照射,MTT法检测HSF细胞增殖活性;DCFH-DA荧光探针检测HSF细胞内ROS水平;采用尼罗红荧光染色法检测过氧化脂质水平;彗星实验察看彗星电泳图、DNA迁移效应;酶生化法检测HSF细胞质中乳酸脱氢酶(LDH)的释放量、SOD和GSH-Px的活性。4.采用qRT-PCR检测枸杞多糖干预后HSF细胞内nrf2 mRNA、bach1 mRNA及下游II相解毒酶sod、cat、nqo1、gclc、gclm mRNA基因的表达;Westernblotting检测Nrf2蛋白在细胞内表达及分布变化。5.设计并构建Nrf2的干扰短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),通过慢病毒转导到HSF细胞,筛选Nrf2表达下降的稳转细胞--Nrf2~(KD) HSF细胞。6.分别采用MTT法、DCFH-DA荧光探针、尼罗红荧光染色法及酶生化法检测LBP对UV致Nrf2~KDD HSF细胞的增殖活性、ROS水平、过氧化脂质水平和SOD、GSH-Px活性的影响。【结果】1.不同浓度枸杞多糖(100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、1000μg/ml、1500μg/ml、2000μg/ml)处理HSF细胞后,倒置光学显微镜下察看各组HSF细胞状态无显著差别,MTT结果显示:当枸杞多糖浓度≤300μg/ml时,HSF细胞的增殖活性不受影响(P0.05),当浓度300μg/ml时,枸杞多糖可抑制HSF细胞增殖能力(P0.05);故筛选300μg/ml的枸杞多糖用于后续实验。2.浓度为300μg/ml枸杞多糖在280-400 nm UV波长范围内的吸光值均0.3。3.采用含300μg/ml的枸杞多糖培养基孵育HSF细胞,分别行UVA/UVB照射,MTT结果显示:和空白组比较,单纯UV辐射显著抑制HSF细胞增殖活性(P0.05);与UVA组和UVB组比较,光照前给予枸杞多糖处理组增殖活性增加(P0.05)。与UV组比较,枸杞多糖预处理组LDH释放量、ROS水平、过氧化脂质含量均显著降低(均P0.05),细胞内SOD、GSH-Px活性明显升高(均P0.05)。彗星实验结果显示:与UV组相比,照光前予枸杞多糖处理组的DNA荧光强度减弱,尾长缩短,DNA损伤程度明显减轻。4.枸杞多糖处理HSF细胞后,qRT-PCR结果显示,与空白组相比,300μg/ml枸杞多糖组nrf2 mRNA表达显著增加,bach1 mRNA表达降低。同时Nrf2下游II相解毒酶基因如sod,cat,nqo1,gclc,gclm mRNA的表达均明显上调(均P0.05)。Western Blot结果显示,300μg/ml枸杞多糖组Nrf2核蛋白的相对表达量显著高于100μg/ml枸杞多糖组及600μg/ml枸杞多糖组(均P0.05)。5.采用慢病毒包装体系,使得Nrf2核酸及蛋白表达量水平抑制率均达70%以上,成功构建Nrf2~KDD HSF稳定细胞株。6.UV照射致Nrf2~KDD HSF细胞组的增殖活性、SOD、GSH-Px活力明显下降,ROS、过氧化脂质含量显著升高,相比正常HSF组细胞,枸杞多糖保护作用明显减弱或丧失了UV对细胞致光损伤的防护作用(均P0.05)。【结论】1.枸杞多糖对UVA/UVB致HSF细胞的急性光损伤具有防护作用。2.枸杞多糖防护急性光损伤的机制可能是通过调控Nrf2信号通路,诱导Nrf2核转位,上调Nrf2、下游II相解毒酶及抗氧化酶基因的表达,清除UV照射产生的过量ROS,抑制脂质过氧化,减轻DNA链断裂损伤,增强细胞活性,从而发挥抗氧化应激损伤。
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

示意图,位点,示意图

将酶切位点换成pLVX-shRNA2 的 BamHI 和 EcoRI，然后再加一个鉴定用的酶切位点 MluI。如图2-1 所示，箭头所指即为酶切位点。图 2-1 干扰位点示意图具体位点设计如下：5’-GATCCGGGAGGAGCTATTATCCATTCTTCAAGAGAGAATGGATAATAGCTCCTCCCTTTTTTACGCGTG-3’3’-GCCCTCCTCGATAATAGGTAAGAAGTTCTCTCTTACCTATTATCGAGGAGGGAAAAAATGCGCACTTAA-5’(2) 载体的构建用去离子水将每条 oligo 均稀释到 50 μM，各取成对的 oligo 4.5 μl，再加入 1μl 10X PCRbuffer，于 95℃ 、3 min，待降至室温。将 pLVX-shRNA2 质粒用 BamHI和 EcoRI 双酶切，尽量保证载体被所有的双酶切开。然后取 1 μl 退火后的溶液，与载体连接并转化。进行质粒的提取和验证时，抽提质粒需用 MluI 单酶切

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广州医科大学硕士学位论文第三部分实验结果 HSF 细胞增殖活性的影响示，当枸杞多糖的浓度 ≤ 300 μg/ml 时，其对 HSF 细均 P > 0.05）；当浓度为 300 -2000 μg/ml 时，枸杞多性（均 P < 0.05）。故选取 300 μg/ml 枸杞多糖用于

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