高通量测序和qRT-PCR研究何首乌肝损伤大鼠肠道菌群的变化

发布时间：2020-06-27 00:16

【摘要】：目的:近年所见何首乌的毒性反应中,屡经报道的为对肝脏的损害。从细胞、分子水平研究何首乌肝损伤的毒性机制是常用的方法,但是近年来的研究发现肠道菌群与肝脏疾病病程的发生、发展有很大的相关性。目前罕见关于何首乌肝损伤与肠道菌群的关系的文献报道,本研究旨在本课题组前期建立的LPS诱导何首乌的大鼠肝损伤评价模型的基础上,采用Illumina高通量测序技术和实时荧光定量PCR(q RT-PCR)研究何首乌肝损伤大鼠肠道中栖息的微生物的变化,探讨其可能的毒性作用机制,为何首乌在临床、保健等领域合理、科学应用提供理论参考和依据。方法:参考本课题组前期建立的由LPS激活的何首乌肝损伤动物评价模型的方法,将所有实验动物任意组合为未处理(C)组、LPS(L)组、LPS联合对乙酰氨基酚给药(LA)组、单独给予何首乌(P)组和LPS联合何首乌给药(LP)组,6只动物/组;共4个时间点:即第2小时、第14小时、第5天和第8天,其中第2小时只有C组和L组(此时所有实验SD大鼠只做给予LPS和未给予LPS处理的区别),其他3个时间点均含以上5个组别。实验当天,L、LA和LP组大鼠尾iv给予0.004 g/Kg的LPS,C和P组以同样的方式iv生理盐水;给予LPS 2小时后,LA组大鼠ig 0.625 g/Kg的APAP,P组和LP组大鼠ig 12 g生药/Kg的何首乌,此后时间,服用药物频率为1次/d,周期为一周,并记录不同时间点不同组别大鼠体重。取2、14 h、5、8 d不同组别大鼠的血液样品和肝脏组织,其中血液样品用于分析ALT、AST和LPS值变化,肝脏组织用于记录肝重及制成病理片观察组织病变;取以上4个时间点C组、L组、P组和LP组大鼠的粪便样品,提取粪便中微生物的总DNA,DNA质检合格后PCR扩增,然后对16S r DNA的V4可变区进行高通量测序,检测本研究中何首乌肝损伤大鼠肠道菌群的α和β多样性、菌群的相对丰富程度、LEf SE检测寻找差异物种,最后采用q RT-PCR法验证高通量测序所得出差异物种的量化分析结果。结果:经LPS诱导2小时后,与C组比较,L组大鼠血清检测发现ALT、AST和LPS值显著增大,体重明显减轻,肝脏出现轻微地肿胀;到第8天时,与C组比较,P组动物各指标检测正常,L组ALT、AST和LPS值的改变不具有统计学意义,体重恢复增长,肝脏HE染色观察发现少量微小肉芽肿;与L组比较,LA组ALT、AST和LPS值显著升高,体重增长受到抑制,且肝组织病理检查可见肝实质多处散在微小肉芽肿和淋巴细胞浸润,LP组大鼠体重显著下降,且肝组织病理学检查发现肝实质多处散在微小肉芽肿和轻度变性的肝细胞,结果提示LPS诱导何首乌的肝脏损害动物模型已建立,可用于何首乌肝损伤的进一步研究。对不同时间点不同组别共54个大鼠粪便样品进行Illumina高通量测序分析,共获得3429945个原始数据,3402523个高质量Tags,有效数据数为3177193,总碱基数为803105345 nt,平均14872321.2 nt,序列平均长度为253 bp。α多样性分析发现,稀释曲线表明本研究所测的数据量合理,物种累积曲线表明本研究所用样本量充足,可进行下一步分析;α多样性指数——辛普森、Chao1和ACE指数均无异常变化,但是香浓指数结果分析发现LPS联合何首乌给药7天后大鼠肠道中栖息着微小生命体的种类增多,结构趋向于复杂化。β多样性结果分析发现,主成分分析、主坐标分析表明不同时间点各组大鼠肠道微生物菌落结构差异不明显,但基于加权Unifrac距离的UPGMA聚类分析发现其有一定的差异。且LEf SE分析也显示各组间存在着不同的具有显著性差异的差异物种,说明了不同时间点LPS联合何首乌给药组与其他组别微生物结构存在一定的差异。Illumina高通量测序和实时荧光定量PCR法研究均发现,第14小时,与C组比较,给予LPS的组别(L组和LP组)大鼠表现为肠杆菌科细菌数显著升高;随着何首乌给药次数的增加,与C组和L组比较,LPS联合何首乌给药组大鼠表现为毛螺旋菌科、肠球菌科细菌数增加,乳杆菌属细菌数减少,说明了LPS联合何首乌给药组大鼠肠道微生物菌落在第8天出现了一定程度的菌群失衡。结论:1.LPS诱导何首乌的肝脏损害动物评价模型的构建已完成,可用于进一步的关联性分析和研究。2.何首乌肝损伤大鼠肠道微生物菌群的多样性增加,菌种丰度发生了变化表现为肠球菌科和毛螺旋菌科细菌数增加,乳杆菌属细菌数减少,何首乌肝损伤大鼠肠道微生物出现了轻度失调的现象。3.Illumina高通量测序和实时荧光定量PCR法在对微生物进行定量分析时,具有良好的一致性,但是前者可得到更全面地、更有深度的微生物信息,更具有优势。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

代谢过程,肠道免疫,研究概述,技术

图 1 “肠肝轴”之间的互动Fig.1 The interaction of Liver-gut-axis群研究概述与分析技术息着近千种微生物，数量近 1014个[40]，它们与宿主存在着互惠体营养吸收、肠道免疫、作为信息呈递的载体等过程[41]。这些体的“代谢器官”[42]，参与机体的不同代谢过程，可通过参与胆质的代谢过程[43]而影响“肠肝循环”和“脑肠轴”[44]。已有文献报[45]、代谢功能[46-48]、中枢神经系统[49]等异常导致的疾病有关。究常用的科学技术为我们更有深度、更加系统地了解肠道菌群培养技术、变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Elec、温度梯度凝胶电泳（TemperatureGradient Gel Electrophoresi片（DNA microarrays）技术、实时荧光定量 PCR（Real-timeR）技术和新一代测序（Next Generation Sequencing, NGS）技术

模式图,二级质谱,何首乌,负离子

图 1-1 何首乌醇提液一、二级质谱图（负离子模式）Fig1-1 The primary and secondary mass spectra of Polygonum multiflorum ethanolextracts (negative ion mode)（图中，a、b 分别表示一、二级质谱；1 为儿茶素；2 为大黄素；3 为没食子酸；4 为大黄素甲醚和/或大黄酸；5 为大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷；6 为二苯乙烯苷）1.2 动物SD 品种大鼠，SPF 级，雄性，体质量（170~190g），购于北京维通利华实验动物科技有限公司，动物合格证编号 SCXK（京）2012-0001。所有动物于军科院六所的安评中心（NBCDSER）GLP 实验室环境中进行常规饲养，并每天模拟照明状态下 12小时，黑暗状态下 12 小时，温度控制在 20℃-24℃，湿度保持在 40%-70%，自由饮食、水。所有动物至少适应性饲养 72 小时后供试。1.3 仪器仪器名称生产厂家

【参考文献】