【摘要】：目的:知母是百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎,具有清热泻火、滋阴润燥的功效。用于内热消渴,外感热病,肺热燥咳,骨蒸潮热,高热烦渴,肠燥便秘等症。课题组前期研究发现知母盐炙后具有显著的降血糖作用,通过盐炙前后化学成分的对比研究,发现了3种盐炙后增量成分:知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷。本课题围绕知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷这三种增量成分,进行体外降糖活性及药代动力学研究,对其与盐知母降糖活性关系进行确认,进一步解析盐知母炮制增效的原理,为临床合理使用盐知母提供理论依据。材料与方法:材料:知母药材购于河北省易县,知母饮片购于四川新荷花中药饮片股份有限公司。经辽宁中医药大学药学院(大连校区)翟延君教授鉴定为百合科植物知母Anemarrhena asphodeloides Bge.的干燥根茎。方法:1.盐知母增量成分含量测定采用UPLC-MS液质联用技术,建立盐知母中三种增量成分知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ和芒果苷的含量测定方法,比较不同提取方式盐知母中3种增量成分含量变化,分析3种增量成分与之前药效学实验结果的对应关系,对盐知母增量成分的降糖作用进一步确认。对盐知母乙醇提取物进行不同极性部位分离,得到氯仿、乙酸乙酯部位,采用UPLC-MS液质联用法测定氯仿部位、乙酸乙酯部位3种成分的含量。分析不同样品知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷的含量,结合前期盐知母活性部位筛选的结果,分析、确认盐知母增量成分的降糖作用。2.盐知母增量成分的降血糖作用研究通过探讨知母盐制后增量成分知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷对HepG-2细胞葡萄糖消耗、对NIT-1胰岛β细胞保护及修护作用的影响,进一步验证知母盐炙后降糖作用增强的炮制原理。将HepG-2细胞分为空白对照组、知母皂苷AⅢ组、知母皂苷BⅢ组、芒果苷组、阳性药二甲双胍组,在5%CO_2培养箱中培养24h,饥饿12小时,再加入不同浓度相应的含药或不含药血清培养基,培养24h,采用葡萄糖试剂盒检测培养液中的葡萄糖含量,葡萄糖消耗实验之后,加入cck-8试剂培养2h,用酶标仪测定吸光度(OD),并计算存活率(IC值);采用胰岛素诱导建立胰岛素抵抗HepG-2细胞模型,同上法比较知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ以及芒果苷对胰岛素抵抗的HepG-2细胞葡萄糖消耗的影响。将NIT-1胰岛β细胞分为空白对照组、知母皂苷AⅢ组、知母皂苷BⅢ组、芒果苷组,空白组加含血清1640培养基,其余各组分别加入STZ和不同浓度相应的含药的血清培养基,在5%CO2培养箱中培养48h,加入cck-8试剂,培养2h,用酶标仪测定吸光度(OD);同法培养之后分别采用试剂盒测定NIT-1胰岛β细胞的一氧化氮、丙二醛以及超氧化物歧化酶的含量。3.盐知母增量成分药代动力学比较研究分别给大鼠灌胃生、盐知母醇提物,以知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ以及芒果苷为指标,采用Waters Xevo TQD三重四级杆液质联用色谱仪对血浆等样品定量分析,并应用DAS3.2.7数据分析软件对生、盐知母在大鼠体内的原型药物浓度、吸收速率进行比较,分析知母、盐知母中各指标性成分AUC_(0-t)、AUC_(0-∞),有无显著性差异。分别给大鼠灌胃生、盐知母醇提物,不同时间点收集大鼠粪便、尿液,进行相应的样品处理,采用UPLC-TOF-MS液质联用色谱仪对大鼠排泄产物中的知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ以及芒果苷原型药物含量进行比较,并结合UNIFI数据库分析数据,分析生、盐知母中知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷在大鼠体内原型药物的排泄量。结果:1.盐知母增量成分的含量测定盐知母醇提物中知母皂苷AⅢ,知母皂苷BⅢ、芒果苷含量均高于水提物,三种增量成分均具有显著性差异。结合前期的药效学实验结果分析,知母皂苷AⅢ,知母皂苷BⅢ和芒果苷是盐知母降糖作用增强的物质基础。在盐知母醇提物的氯仿萃取层、乙酸乙酯萃取层中,乙酸乙酯层的知母皂苷AⅢ、芒果苷的含量均高于氯仿层,而氯仿中知母皂苷BⅢ的含量远高于乙酸乙酯,结合前期的药效学实验结果分析,因氯仿层的药效优于乙酸乙酯层,由此推测,在药效实验中知母皂苷BⅢ具有更显著的降糖活性。2.盐知母增量成分的降血糖作用研究知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷各个浓度组均能使正常组HepG-2细胞的葡萄糖消耗增加,与空白对照组相比均有显著性差异(P0.01或P0.05)。以STZ造模后,与空白对照组比较,模型组细胞葡萄糖消耗量显著降低(P0.05),说明HepG-2细胞胰岛素抵抗模型建立成功;知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷各个浓度组均能使胰岛素抵抗HepG-2细胞葡萄糖消耗增加,与模型对照组相比均有显著性差异(P0.01或P0.05)。cck-8实验结果表明,知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷浓度分别为1.0μg/mL、1.0μg/mL、0.02μg/mL时,细胞存活率IC值大于98%。较与模型组相比,知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ以及芒果苷都可改善NIT-1胰岛β细胞的NO水平,其中知母皂苷BⅢ组在4μg/mL改善NIT-1胰岛β细胞的NO水平尤为显著(P0.05);由SOD活力结果可见,模型组活力较对照组明显降低,差异有统计学意义(P0.05),知母皂苷AⅢ组、知母皂苷BⅢ组和芒果苷组与模型组相比,有提高SOD活力的趋势;知母皂苷BⅢ(20μg/ml+STZ)组与模型组相比,能明显增加SOD活力(P0.05);MDA活力结果显示,模型组活力较对照组明显升高,差异有统计学意义(P0.05),知母皂苷AⅢ组、知母皂苷BⅢ组和芒果苷组与模型组相比,有降低MDA活性的趋势,且芒果苷组作用尤为显著(P0.01)。推测知母盐制后增量成分可能通过改善NO、MDA、SOD途径修护胰岛β细胞损伤。2.盐知母增量成分的药代动力学研究大鼠分别灌胃生知母、盐知母提取物后,血浆中知母皂苷AⅢ的达峰浓度Cmax生知母为4.483±0.508(mg/L),半衰期t1/2生知母为1.818±0.467h;Cmax盐知母为2.183±0.440(mg/L),半衰期t1/2盐知母为2.062±0.256h,血浆中平均滞留时间MRT_(0-t)、MRT_(0-∞)延长。知母皂苷AⅢ血药浓度-时间曲线下面积AUC_(0-t)生知母为16.463±4.203(mg/L*~h),AUC_(0-∞)生知母为16.48±4.216(mg/L*~h);AUC_(0-t)盐知母为7.159±1.378(mg/L*~h),AUC_(0-∞)盐知母为7.163±1.382(mg/L*~h)。知母皂苷BⅢ的达峰浓度Cmax生知母为13.45±3.663(mg/L),半衰期t1/2生知母为2.519±0.788h;Cmax盐知母为12.717±2.257(mg/L),半衰期t1/2盐知母为2.665±0.516h,血浆中平均滞留时间MRT_(0-t)、MRT_(0-∞)延长。知母皂苷BⅢ血药浓度-时间曲线下面积AUC_(0-t)生知母为75.596±29.438(mg/L*~h),AUC_(0-∞)生知母为75.959±29.384(mg/L*h);AUC_(0-t)盐知母为101.817±25.414(mg/L*~h),AUC_(0-∞)盐知母为102.355±25.155mg/L*h。芒果苷的达峰浓度Cmax生知母为33.917±2.559(mg/L),半衰期t1/2生知母为3.513±0.358h;Cmax盐知母为33.637±4.675(mg/L),半衰期t1/2盐知母为5.134±1.045h,血浆中平均滞留时间MRT_(0-t)、MRT_(0-∞)延长。芒果苷血药浓度-时间曲线下面积AUC_(0-t)生知母为167.746±24.332(mg/L*~h),AUC_(0-∞)生知母为171.289±25.781(mg/L*~h);AUC_(0-t)盐知母为202.742±53.526(mg/L*~h),AUC_(0-∞)盐知母为210.698±55.206(mg/L*~h)。大鼠分别灌胃生知母、盐知母提取物后,定点(0~6h,6~12h,12~24h,24~36h,36~48 h)收集其排泄的尿液及粪便,建立UPLC-MS研究生、盐知母大鼠体内排泄途径研究的方法,根据不同时间生、盐知母中知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷在尿液、粪便中的含量,计算生、盐知母中知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷在大鼠尿液、粪便中累积排泄量,尿液在24小时内,生知母组的排泄量:知母皂苷AⅢ(122.38±3.72)、知母皂苷BⅢ(22.80±1.39)、芒果苷(53.88±1.30);而在粪便中,知母皂苷AⅢ(30.14±1.49)、知母皂苷BⅢ(11.71±1.44)、芒果苷(23.19±0.85)。尿液在24小时内,盐知母组的排泄量:知母皂苷AⅢ(124.75±5.51)、知母皂苷BⅢ(24.75±3.41)、芒果苷(71.24±2.38);而在粪便中,知母皂苷AⅢ(36.72±2.20)、知母皂苷BⅢ(13.22±2.22)、芒果苷(49.63±1.82)。研究中还发现,知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷在大鼠尿液、粪便中以原型形式排泄的量较少。推测知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷可能主要以代谢产物的形式进行体内消除,因此有必要对其代谢产物进行研究,为最终确定其代谢途径和药效物质基础研究提供理论依据。结论:盐知母中的增量成分知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ、芒果苷均有降糖作用,且盐炙后能增加知母皂苷AⅢ、知母皂苷BⅢ及芒果苷在大鼠体内的吸收,与前期证明的盐知母降糖作用直接相关,是盐知母炮制增效的物质基础。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284;R285.5
【图文】：
盐知母醇提物供试品的总电子流图
盐知母水提物供试品的总电子流图
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本文编号：
2731124
