金茵清热口服液通过TLR通路介导的免疫调节作用及机制研究

发布时间：2020-06-27 07:57

【摘要】：金茵清热口服液是湖北中医药大学联合十堰市太和医院研制的复方中药制剂,由金银花、茵陈、栀子、大黄、黄芪、甘草、连翘、丹参8味中药材组成。该方在前期经过了处方优化、毒性、稳定性、药效学、临床疗效及抗流感病毒实验等研究,证明其具有清热解毒、活血凉血等功效,用于治疗流感临床疗效显著,同时能够提高机体的免疫功能。在现代的中医药理论及实践中均证明了中医药能够通过影响机体的免疫功能达到一定的治疗效果。研究表明,许多中药是通过Toll样受体(Toll likereceptors,TLRs)信号通路来发挥免疫调节作用。课题组通过金茵清热口服液抗甲型H1N1流感病毒致Hep-2细胞病变实验发现,试药能显著上调Hep-2细胞的抗病毒因子IFN-1α和TNF-α水平,下调炎性因子如白介素IL-1α和IL-6水平;因此,为探索金茵清热口服液对免疫细胞的作用及其机制,本研究利用人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),研究金茵清热口服液对免疫细胞中TLRs信号通路的作用,及其信号通路相关基因及蛋白的影响,探究TLRs信号通路在金茵清热口服液发挥免疫调节作用中的作用。目的:探索金茵清热口服液(试药)能否通过TLRs信号通路发挥免疫调节作用;研究金茵清热口服液通过哪些TLRs信号通路发挥免疫调节作用;进一步阐述金茵清热口服液介导的TLR2信号免疫调节作用机制。方法:1.TLR1-10及GAPDH标准曲线的建立采用LPS孵育PBMC,提取PBMC总RNA作为模板,Primer 5.0引物软件设计TLR1-10及GAPDH引物,PCR法得到TLR1-10及GAPDH扩增产物,制备TLR1-10及GAPDH标准品,分别建立不同的实时荧光定量PCR标准曲线,优化PCR反应条件,并对该方法扩增效率及特异性进行检测。2.金茵清热口服液对PBMC中TLRs mRNA表达的影响用不同浓度的试药孵育PBMC,采用MTT比色法检测细胞活性,计算试药对细胞的最大无毒浓度(TC0);设空白对照组和试药组,RT-PCR检测TLR1-10 mRNA的表达情况。3.金茵清热口服液对PBMC中TLR2信号通路的影响利用RT-PCR法和Western Blot法检测空白对照组和试药组PBMC 中相关信号分子 TLR2、MyD88、IRAK4、TRAF6、IRF3 mRNA和蛋白的表达情况,ELISA法检测细胞因子IL-1α、IL-6、TNF-α、IFN-α的分泌水平;分别设抑制剂组、空白对照组、试药组、激动剂组,提取核蛋白和浆蛋白,Western Blot法检测IRF3和NF-κB p65的核转位,并进行灰度分析。结果:1.建立了 TLR1-10及GAPDH的标准曲线:各基因的Ct值和标准品浓度间线性关系良好,相关系数R2均大于0.995以上;扩增效率基本都大于90%;其检测下限为1×103 copies·μl-1,证明其灵敏度高;无引物二聚体及非特异性扩增产物出现,可以反应这些引物的特异性良好。2.金茵清热口服液显著上调PBMC的TLR1、2、6 mRNA表达:MTT法检测PBMC存活率,得到TC0为2.015 mg·mL-1;RT-PCR法结果显示,试药组中TLR5、TLR7、TLR8 mRNA水平分别下调53%、21%、15%,而 TLR1 上调 4.11 倍,TLR2 上调 6.32 倍,TLR6 上调 5.58 倍,TLR9 上调 1.53 倍(p0.05)。3.金茵清热口服液活化MyD88依赖的TLR信号通路:试药对TLR2、MyD88、TRAF6 mRNA 表达分别上调 5.93 倍、1.77 倍、2.95倍;对MyD88、TRAF6蛋白的表达分别上调1.26倍、1.24倍;对细胞因子IL-1α、IL-6的表达下调55%、61%;TNF-α、IFN-α的分泌水平上调4.3倍、2.9倍,差异有统计学意义(p0.05)。4.TLR2抑制剂可以阻断金茵清热口服液对PBMC的免疫活化作用:金茵清热口服液处理PBMC后,IRF3及NF-κB发生核转位,但是经过TLR2抑制剂预处理后,IRF3和NF-κB的核转位显著抑制,甚至低于未经任何处理的空白对照组。相反,TLR2激动剂预处理可以进一步上调金茵清热口服液介导的IRF3和NF-κB的核转位。结论:1.金茵清热口服液显著上调PBMC中TLR1、2、6mRNA表达,提示其可能主要通过TLR1、TLR2及TLR6信号通路来发挥免疫调控作用;2.金茵清热口服液可以上调PBMC的抗病毒天然免疫;3.金茵清热口服液可以活化MyD88依赖型TLR信号通路,而且TLR2抑制剂可以阻断金茵清热口服液介导的IRF3和NF-κB的核转一位,表明TLR2信号通路在金茵清热口服液的免疫调节功能中发挥关键作用。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

细胞内,试药,表达水平,空白

３．２邋ＲＴ－ＰＣＲ检测试药对ＴＬＲ１－１０邋ｍＲＮＡ表徸的影响逡逑提取ＰＢＭＣ的ＲＮＡ，Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ检测试药对ＴＬＲ１－１０的影逡逑响（见图５），结果显示，ＴＬＲ１－１０的２－＾＾分别为：４．１１２±０．３０６、逡逑６．３２士０．０４３、１．４０４士０．０２５、１．０２８±０．００３、０．４６６±０．０６７、５．５８±０．２０５、逡逑０．７９±０．０４７、０．８４７士０．０１２、１．５３４土０．２４３、０．９２±０．０４３；表明试药组中逡逑ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８ｍＲＮＡ邋水平分别下调邋５３％、２１％、１５％；其他逡逑ＴＬＲｓ均比空白组的ｍＲＮＡ表达水平高，ＴＬＲ１上调４．１１倍，ＴＬＲ２逡逑上调邋６．３２邋倍，ＴＬＲ６邋上调邋５．５８邋倍，ＴＬＲ９邋上调邋１．５３邋倍（ｐ＜０．０５）。逡逑１９逡逑

试药,核蛋白,蛋白

分别用抑制剂、试药、激动剂孵育ＰＢＭＣ，具体操作如“２．４”逡逑提取各组ＰＢＭＣ中的核蛋白及浆蛋白，Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ法检测核蛋白及浆逡逑蛋白中的表达（见图９）。逡逑＊＊．＃rP欤椋簦rP停]3?ＩＲＦ３逦ｍｍｍｍｍｍ逡逑ｉ蛋＊逦该圣合逡逑图９．试药处理前后浆蛋白及核蛋白中ＩＲＦ３、ＮＦ－ｋＢ的表达情况逡逑Ｆｉｇｕｒｅ９邋．Ｔｈｅ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｅｖｅｌｓ邋ｏｆ邋ＩＲＦ３邋ａｎｄ邋ＮＦ－？ｃＢ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｓｅｒｕｍ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ａｎｄ逡逑ｎｕｃｌｅａｒ邋ｐｒｏｔｅｉｎｓ邋ＰＢＭＣ邋ｔｒｅａｔｅｄ邋ｗｉｔｈ／ｗｉｔｈｏｕｔ邋ＪＹＱＲＯＬ逡逑３５逡逑

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