基于“补肾生髓成肝”肝癌三级预防方案的系统评价与实验研究

发布时间：2020-06-27 13:56

【摘要】：目的:1、通过系统性评价与Meta分析的循证医学手段,科学地评估基于“补肾生髓成肝”肝癌三级预防方案防治肝癌的临床随机对照试验的方法学质量及相关数据,为“补肾生髓成肝”之法防治肝癌提供可靠的循证医学证据。2、基于网络药理学对体现“补肾生髓成肝”之法的地五养肝胶囊进行药理学预测及分析其防治肝癌的相关作用机制(“干性实验”),为后续细胞实验提供基础。3、研究地五养肝胶囊对人骨髓间充质干细胞-肝癌细胞共培养体系中(以下简称为共培养体系)肝癌细胞的影响及机制,探讨“补肾生髓成肝”(地五养肝胶囊)调控“髓生肝/髓失生肝”失衡防治肝癌发生发展的疗效机制(“湿性实验”)。方法:1、通过检索相关期刊论文(CNKI)、万方数据库、中文科技期刊全文数据库(VIP)、中国生物医学文献数据库(CMB)、中国临床试验注册中心(http://www.chictr.org/cn/)及英文数据库MEDLINE、EMBASE、the Cochrane Central Register of Controlled Trials(CENTRAL)、The Cochrane Hepato-Biliary Group Controlled Trials Register等在内的11个中英文数据库,来收集体现基于“补肾生髓成肝”肝癌三级预防方案防治原发性肝癌的临床随机对照试验文献的基础上,严格按照循证医学方法对这些临床文献研究质量进行评价及数据的提取,临床疗效及相关实验室指标采用软件Rev Man 5.3进行异质性检验、Meta分析和敏感性分析。对不良反应进行描述性分析。对发表偏倚情况进行漏斗图分析。为基于“补肾生髓成肝”肝癌三级预防方案防治肝癌提供循证医学证据。2、采用网络药理学的方法对地五养肝胶囊防治肝癌的作用机制进行预测分析,实验步骤如下:以地五养肝胶囊中五种中药成分:熟地、茵陈、五味子、甘草、姜黄为中心词,在TCMSP数据库中进行查询,以OB≥30%或DL≥0.18为标准对其化合物进行筛选,合并5种药物成分,删除冗杂。通过Onco DB.HCC、Liverome及TCMSP三个数据库进行肝癌相关基因的检索。运用Uniprot数据库查询肝癌相关基因ID号,看其是否符合人类基因的同时对其进行整理。将最终筛选所得的化合物与人类肝癌相关基因进行相互映射,用Cytoscape软件构建地五养肝胶囊成分-靶标网络图,同时将这些符合条件的靶标蛋白输入String数据库进行蛋白-蛋白相互作用网络构建。用Clue One软件对KEGG Pathway进行富集分析,得出地五养肝胶囊治疗肝癌的作用机制。3、基于网络药理学和课题组前期研究成果,细胞实验部分将着重探讨地五养肝胶囊对Wnt通路的调控作用。细胞实验将分两部分进行:实验一:通过MTT法测出地五养肝胶囊对肝癌细胞HCCL-M3的IC50后,设计低浓度药物组(20μg/ml)、中浓度药物组(40μg/ml)、高浓度药物组(80μg/ml),分别作用于肝癌细胞,收集24h、48h、72h细胞进行检测。用MTT法、流式细胞术检测肝癌细胞的增殖及凋亡情况。RT-PCR法检测Wnt通路中关键信号分子mRNA的表达。实验二:根据课题组前期研究成果,用10%地五养肝药物血清作用于共培养体系21天。通过CCK8、Transwell肿瘤侵袭观察24h地五养肝药物血清对共培养体系中肝癌细胞的影响,流式细胞术观察14天、21天肝癌细胞及骨髓干细胞的凋亡情况,Western Blot及RT-PCR检测7天、14天、21天Wnt通路中关键信号分子的表达情况。结果:1、基于Meta分析的临床试验:总共纳入18篇文献,合计2213例原发性肝癌患者及存在肝癌发生风险患者。在临床有效率方面,根据对照组中西医的治疗情况不同,分为介入组、放疗组及消融组三组来进行亚组分析。结果显示:基于“补肾生髓成肝”肝癌三级预防方案(试验组)效果优于单纯西医治疗(对照组),RR=1.07(95%CI:1.03 to 1.12)。中医症状和体征疗效、KPS生活质量评分、降低AFP值及AST值等方面,结果显示试验组疗效显著优于对照组,RR分别为RR=1.71(95%CI:1.51to 1.93)、RR=1.13(95%CI:1.07 to 1.20)、RR=-0.32(95%CI:-0.58to-0.05)、RR=-0.51(95%CI:-0.76 to-0.26)。在升高NK细胞值方面,以疗程3个月为界,分2组进行亚组分析:其中疗程在3个月以上者,因组间异质性大,选取其中高质量文献进行敏感性分析得出,试验组治疗后NK细胞数明显高于对照组,RR=0.17(95%CI:0.03 to 0.30)。疗程为3个月以下者,试验组治疗后NK细胞数明显高于对照组,RR=1.63(95%CI:1.04 to 2.22)。在不良反应方面,总体上来说,基于“补肾生髓成肝”肝癌三级预防方案在不良反应发生率及出现不良反应的程度上来看,均要少于、轻于单纯西医治疗。2、网络药理学分析结果:以OB≥30%或DL≥0.18为标准最终筛选出与人类肝癌相关的靶标蛋白56个。通过Cytoscape软件得出成分-靶标网络图后,发现地五养肝胶囊总共作用肝癌的有效化合物分子为98个,对应的总靶标为56个。String数据库进行蛋白-蛋白相互作用的网络构建,得出地五养肝胶囊治疗肝癌的蛋白与蛋白互作图,图中包含得到415个相互作用关系,平均节点度为15.7。通过KEGG Pathway富集分析得出地五养肝胶囊治疗肝癌相关的包括P53、PPAR、TNF、Wnt、VEGF等在内的106个通路,为后续细胞实验提供基础。3、细胞实验结果:实验一:地五养肝胶囊对肝癌细胞的影响及其机制,结果表明:MTT法测肝癌细胞增殖情况结果:24h低浓度药物组肝癌细胞抑制率为(0.137±0.010)、中浓度药物组为(0.232±0.006)、高浓度药物组为(0.305±0.003),低、中、高药物组抑制率明显高于对照组,经过统计所得,差异显著,P0.05,具有统计学意义。同时,低、中、高三组药物细胞抑制率表现为逐渐升高,经过统计学处理得出其差异显著,P0.05。48h低浓度药物组肝癌细胞抑制率为(0.291±0.012)、中浓度药物组为(0.399±0.017)、高浓度药物组为(0.600±0.007),明显高于对照组,组间差异显著,P0.05。同时,低、中、高三组之间比较所得,高浓度药物组肝癌细胞抑制率明显高于中浓度药物组和低浓度药物组,中浓度药物组亦明显高于低浓度药物组,P0.05,差异显著,具有统计学意义。72h检测所得,低浓度药物组细胞抑制率为(0.319±0.028)、中浓度药物组为(0.578±0.003)、高浓度药物组为(0.713±0.007),三组药物组均明显高于对照组,经过统计所得,差异显著,P0.05,具有统计学意义。同时,低、中、高三组比较,差异显著,P0.05。此外,将低、中、高药物组24h、48h、72h三个时间点的细胞抑制率进行同组间比较发现,中、高浓度药物组的细胞抑制率随着时间的推移,效果逐渐增强,差异显著,P0.05。流式细胞术检测肝癌细胞凋亡结果表明:24h低浓度药物组早期凋亡为(7.76±0.56)、中浓度药物组为(7.88±0.81)、高浓度药物组为(10.38±1.13)明显高于对照组(3.22±0.12),组间差异显著,P0.05;同时,低、中、高浓度药物组三组早期凋亡之间进行比较,结果表明随着药物浓度的增长,其凋亡率逐渐升高,差异显著,P0.05,具有统计学意义。中浓度药物组晚期凋亡为(9.65±0.76)、高浓度药物组为(11.85±0.79)明显高于对照组(4.62±0.18),差异显著,P0.05,具有统计学意义。同时,低、中、高浓度药物组晚期凋亡率组间进行比较,结果表明随着药物浓度的增长,其凋亡率逐渐升高,差异显著,P0.05。低浓度药物组总凋亡为(12.15±0.86)、中浓度药物组为(17.53±0.84)、高浓度药物组为(22.23±1.24),三组药物组均明显高于对照组(7.84±0.22),组间比较,差异显著,P0.05;同时,低、中、高浓度三组药物组总凋亡随着浓度的升高,其凋亡率逐渐升高,差异显著,P0.05,具有统计学意义。48h低浓度药物组早期凋亡为(10.69±0.46)、中浓度药物组为(14.79±0.82)、高浓度药物组为(12.99±0.60)明显高于对照组早期凋亡(3.92±0.27),四组间比较,差异显著,P0.05。低浓度药物组晚期凋亡为(5.11±0.30)、中浓度药物组(15.05±0.26)、高浓度药物组(29.43±0.87),三组药物组明显高于对照组(4.81±0.12),组间比较,差异显著,P0.05;同时,三组药物组之间进行比较发现,其晚期凋亡随着药物浓度的升高,凋亡愈加明显,组间比较差异显著,P0.05。低浓度药物组总凋亡为(15.80±0.76)、中浓度药物组为(29.84±1.04)、高浓度药物组为(42.42±0.91),三组药物组总凋亡率明显高于对照组(8.74±0.39),组间差异显著,P0.05;同时,低中高三组药物组总凋亡随着药物浓度的升高,其凋亡率逐渐升高,差异显著,P0.05,具有统计学意义。72h低浓度药物组早期凋亡为(8.20±0.43)、中浓度药物组(13.04±0.36)、高浓度药物组(11.11±0.99),三组药物组均明显高于对照组(4.66±0.33),四组间比较,差异显著,P0.05。低浓度药物组晚期凋亡为(8.84±0.59)、中浓度药物组为(26.15±0.94)、高浓度药物组为(56.71±0.61),三组药物组均明显高于对照组(5.08±0.30),组间差异显著,P0.05;同时,三组药物组之间进行比较发现,其晚期凋亡随着药物浓度的升高,其凋亡愈加明显,组间比较差异显著,P0.05。低浓度药物组总凋亡率为(17.05±0.92)、中浓度药物组为(39.19±1.30)、高浓度药物组为(67.82±1.44),均高于对照组(9.75±0.42),四组间比较,差异显著,P0.05;同时,低、中、高三组药物组总凋亡随着药物浓度的升高,其凋亡率逐渐升高,差异显著,P0.05,具有统计学意义。此外,分别将低、中、高三组药物24h、48h、72h三个时间点的总凋亡进行同组间的比较,发现随着药物作用时间的延长,每组药物对肝癌细胞的总凋亡逐渐增加,差异明显,P0.05,具有统计学意义。RT-PCR检测Wnt信号通路中关键信号分子mRNA表明:24h时,中浓度药物组β-catenin mRNA表达为(0.48±0.08),高浓度药物组为(0.44±0.06),两组药物组均明显低于对照组,差异显著,P0.05;同时,中、高浓度药物组明显低于低浓度药物组(0.95±0.15),经过统计P0.05,差异显著。48h时,低浓度药物组为(0.42±0.08)、中浓度药物组为(0.26±0.01)、高浓度药物组为(0.09±0.02),三组药物组均明显低于对照组,差异显著,P0.05;同时,中浓度药物组亦低于低浓度药物组,差异显著,P0.05。72h时,低、中、高三组药物组β-catenin mRNA表达分别为(0.17±0.05)、(0.24±0.10)、(0.13±0.05)明显低于对照组,经过统计学计算P0.05,差异显著。此外,将中、高浓度药物组24h、48h、72h三个时间点的β-catenin mRNA进行同组间比较,发现48h的β-catenin mRNA表达明显低于24h的表达,P0.05,差异显著。低浓度药物组24h、48h、72h三个时间点的β-catenin mRNA表达进行同组间比较,发现其随着时间的延长,β-catenin mRNA表达逐渐降低,且差异显著,P0.05。24h高浓度药物组GSK3βmRNA表达为(3.34±0.92),明显高于对照组,差异显著,P0.05;同时,高浓度药物组GSK3βmRNA表达亦明显高于低浓度药物组(1.21±0.48)、中浓度药物组(1.37±0.46),差异显著,P0.05。48h中浓度药物组(3.63±1.48)、高浓度药物组(8.69±1.63),两组药物组均明显高于对照组GSK3βmRNA表达,差异显著,P0.05;同时,高浓度药物组亦明显高于中浓度药物组和低浓度药物组(1.19±0.30),差异显著,P0.05。72h低浓度药物组GSK3βmRNA表达为(5.25±1.39)、中浓度药物组为(8.55±3.31)、高浓度药物组为(9.55±3.65),明显高于对照组,差异显著,P0.05。此外,低浓度药物组48h与72h GSK3βmRNA相比,差异显著,P0.05。Cyclin D1 mRNA结果显示:48h低浓度药物组Cyclin D1 mRNA表达为(0.25±0.06)、中浓度药物组为(0.13±0.02)、高浓度药物组为(0.09±0.02),三组药物组明显低于对照组,组间差异显著,P0.05;同时,高浓度药物组和中浓度药物组亦低于低浓度药物组,差异显著,P0.05。72h低浓度药物组GSK3β表达(0.08±0.01)、中浓度药物组(0.10±0.04)、高浓度药物组(0.06±0.01)明显低于对照组,经过统计P0.05,差异显著。此外,低浓度药物组24h、48h、72h的Cyclin D1 mRNA表达逐渐降低,差异显著,具有统计学意义;中、高浓度药物组24h、48h的Cyclin D1 mRNA表达同组间相比较,其表达逐渐降低,差异显著,P0.05。实验二:采用人骨髓间充质干细胞-肝癌细胞体外共培养体系来模拟人体内“髓失生肝”的病理状态通过CCK8法检测共培养体系中肝癌细胞的增殖,结果表明:地五养肝药物血清组OD值为(0.623±0.014),明显低于正常对照组(0.840±0.019)和空白血清对照组(0.812±0.021),三组间比较,差异显著,P0.05。通过公式计算得出的细胞抑制率结果发现,地五养肝药物血清组为(0.257±0.034)明显高于空白血清对照组(0.033±0.003),两组间比较,差异显著,P0.05。流式细胞术检测共培养体系中肝癌细胞的凋亡情况发现:第14天结果显示,地五养肝药物血清组早期凋亡(14.89±2.50)和总凋亡率(22.26±1.54)、空白血清对照组早期凋亡率(10.42±0.92)和总凋亡率(14.50±1.99),两组均明显高于正常对照组早期凋亡(4.79±0.22)和总凋亡(6.54±0.16),三组间比较,差异显著,P0.05;同时,地五养肝药物血清组早期凋亡和总凋亡亦明显高于空白血清对照组,两组间比较,差异显著,P0.05,具有统计学意义。第21天结果显示,地五养肝药物血清组早期凋亡率(18.07±0.72)、晚期凋亡率(7.65±0.61)及总凋亡率(25.72±0.95),空白血清对照组早期凋亡率(10.34±0.86)、晚期凋亡率(4.60±0.50)及总凋亡率(14.93±1.26)均明显高于正常对照组,经过统计学处理发现,差异显著,P0.05;同时,分别将地五养肝药物血清组早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率与空白血清对照组相比,发现地五养肝药物血清组明显高于空白血清对照组,两组间差异显著,P0.05。此外,地五养肝药物血清组21天的总凋亡率明显高于14天的总凋亡率,两者相比,差异显著,P0.05。流式细胞术检测共培养体系中骨髓间充质干细胞的凋亡情况所得:第14天结果显示:地五养肝药物血清组晚期凋亡(4.82±0.37)和总凋亡率(15.30±0.83)明显低于空白血清对照组骨髓细胞的晚期凋亡率(8.77±0.51)和总凋亡率(19.25±1.23),两组间比较,P0.05,差异显著。第21天结果表明:地五养肝药物血清组晚期凋亡(6.37±0.38)和总凋亡率(15.04±1.07),明显低于空白血清对照组骨髓细胞的晚期凋亡率(10.64±0.84)和总凋亡率(21.45±1.45),两组间比较,P0.05,差异显著。Transwell肿瘤侵袭实验发现,地五养肝药物血清为(60.00±6.25)明显低于空白血清对照组(89.33±4.16)和正常对照组(96.66±5.03),组间差异显著,P0.05,具有统计学意义。RT-PCR检测β-catenin mRNA表达结果发现:第14天,地五养肝药物血清组(0.63±0.19)、空白血清对照组(0.67±0.18)与正常对照组相比有所降低,差异显著,P0.05,具有统计学意义。第21天,地五养肝药物血清组(0.38±0.16)、空白血清对照组(0.53±0.11)均明显低于正常对照组,差异具有统计学意义,P0.05;同时,地五养肝药物血清组亦明显低于空白血清对照组,差异显著,P0.05。GSK-3βmRNA表达结果显示:第7天,地五养肝药物血清组GSK-3β表达为(1.90±0.38)、空白血清对照组(1.61±0.35),两组均明显高于正常对照组(0.92±0.11),差异显著,P0.05,具有统计学意义。第14天,地五养肝药物血清组(3.35±0.66)、空白血清对照组(2.48±0.46),两组均明显高于正常对照组,三组间差异显著,P0.05;同时,地五养肝药物血清组亦高于空白血清对照组,P0.05,差异显著,具有统计学意义。第21天,地五养肝药物血清组(5.45±0.53)、空白血清对照组(4.85±0.52),两组均明显高于正常对照组,差异显著,P0.05;同时,地五养肝药物血清与空白血清对照组相比,差异显著,P0.05。C-MYC mRNA表达结果:第7天,地五养肝药物血清组C-MYC表达为(0.60±0.14)、空白血清对照组(0.69±0.13),两组均低于正常对照组(0.93±0.18),差异显著,P0.05,具有统计学意义。第14天,地五养肝药物血清组(0.45±0.12)和空白血清对照组(0.65±0.15)均低于正常对照组,三组间差异显著,P0.05;同时,地五养肝药物血清组亦低于空白血清对照组,P0.05,差异显著,具有统计学意义。第21天,地五养肝药物血清组和空白血清对照组均明显低于正常对照组,差异显著,P0.05;同时,地五养肝药物血清组(0.22±0.04)与空白血清对照组(0.37±0.08)相比,差异显著,P0.05,具有统计学意义。Cyclin D1 mRNA表达结果表明:第7天,地五养肝药物血清组Cyclin D1表达为(0.78±0.05),明显低于正常对照组(1.06±0.13),差异显著,P0.05,具有统计学意义。第14天,地五养肝药物血清组(0.53±0.12)和空白血清对照组(0.68±0.11)与正常对照组相比有所降低,差异显著,P0.05。第21天,地五养肝药物血清组(0.25±0.04)及空白血清对照组(0.39±0.07)与正常对照组相比有所降低,差异显著,P0.05;同时,地五养肝药物血清组明显低于空白血清对照组,组间相比,差异显著,P0.05。Western Blot检测β-catenin蛋白表达结果发现:第14天,地五养肝药物血清组β-catenin蛋白表达为(0.36±0.05),明显低于正常对照组(0.76±0.13),经统计学处理,差异显著,P0.05;同时,地五养肝药物血清组蛋白表达亦明显低于空白血清对照组(0.57±0.05),差异显著,P0.05。第21天,地五养肝药物血清组(0.24±0.03)和空白血清对照组(0.68±0.04)均低于正常对照组(0.82±0.02),经过统计学处理,三组间比较差异显著,P0.05;同时,地五养肝药物血清组β-catenin蛋白表达亦低于空白血清对照组,差异显著,P0.05。GSK-3β蛋白表达结果:第14天,地五养肝药物血清组GSK-3β蛋白表达为(0.94±0.22),空白血清对照组为(0.71±0.12),均明显高于正常对照组(0.45±0.06),经统计学处理,差异显著,P0.05。第21天,地五养肝药物血清组GSK-3β蛋白表达为(1.05±0.11)、空白血清对照组(0.76±0.06),均高于正常对照组(0.39±0.07),经统计学处理,差异显著,P0.05;同时,地五养肝药物血清组GSK-3β蛋白表达亦高于空白血清对照组,差异显著,P0.05,具有统计学意义。C-MYC蛋白表达结果表明:第14天,地五养肝药物血清组为(0.34±0.03)、空白血清对照组为(0.57±0.06),两组均低于正常对照组(0.73±0.03),经统计学处理,差异显著,P0.05;同时,地五养肝药物血清组c-MYC蛋白表达亦低于空白血清对照组,经过统计学处理,差异显著,P0.05。第21天,地五养肝药物血清组为(0.36±0.12)、空白血清对照组为(0.78±0.14),均低于正常对照组(0.89±0.15),经过统计学处理,P0.05,差异显著;同时,地五养肝药物血清组蛋白表达亦低于空白血清对照组,差异显著,P0.05。Cyclin D1蛋白表达结果:第7天,地五养肝药物血清组(0.37±0.07)低于正常对照组(0.61±0.10),经过统计,差异显著,P0.05,有统计学意义。第14天,地五养肝药物血清组(0.23±0.04)和空白血清对照组(0.37±0.10)均低于正常对照组(0.50±0.02),差异显著,P0.05;同时,地五养肝药物血清组Cyclin D1表达亦低于空白血清对照组,经过统计学处理,差异显著,P0.05。第21天,地五养肝药物血清组Cyclin D1表达(0.21±0.04)低于正常对照组(0.74±0.03),经过统计学处理,P0.05,差异显著;同时,地五养肝药物血清组亦低于空白血清对照组(0.66±0.06),差异P0.05。结论:(1)通过系统评价及Meta分析结果表明,临床上运用基于“补肾生髓成肝”肝癌三级预防方案防治肝癌较单纯西医治疗,不仅疗效显著、不良反应少,还可改善肝再生微环境来延缓疾病的进程。(2)通过网络药理学预测分析发现地五养肝胶囊作用肝癌的相关机制可能跟Wnt信号通路密切相关。(3)通过2个细胞实验结果表明,地五养肝胶囊不管是单独作用于人肝癌细胞还是在共培养体系中,其对肝癌细胞都有抑制其细胞增殖,降低其侵袭性、诱导其凋亡的作用,效果显著。同时,在共培养体系中发现,地五养肝胶囊有保护骨髓干细胞、抑制肝癌细胞对骨髓干细胞凋亡的作用—“补肾生髓”作用。通过Western blot及RT-PCR检验发现,地五养肝胶囊对肝癌细胞的具体作用机制可能是通过抑制过度激活的Wnt信号通路来改善肝再生微环境从而防止肝癌的发生发展。
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

流程图,流程图,原发性肝癌,诊断标准

图 1 PRISMA 流程图4.1 纳入 RCT 的特点共有 18 个 RCT 合计 2213 例原发性肝癌患者（其中试验组 1336 例，对照组为 877 例），文献中有 2 篇高质量文献，其余 16 篇为低质量文献全部试验均在国内完成。发表年限从 2009 年-2018 年，样本量从 33-60例不等，所有 RCT 均提及基线资料各组间具有可比性。其中原发性肝癌断方面：2 个 RCT[12,19]参照 2001 年中国抗癌协会肝癌专业委员会提出的发性肝癌诊断与分期标准，2 个 RCT[14,25]参照《中国常见恶性肿瘤诊治规范》，1 个 RCT[13]参照中华医学会的《临床诊疗指南·肿瘤分册》，1 个 RCT[参照 2000 年第四届全国肝癌学术会议修正的原发性肝癌诊断标准，1 个RCT[21]参照 1993 年颁布的《中药新药治疗原发性肝癌临床研究指导原则1 个 RCT[20]参照美国肝病研究协会诊断标准，1 个 RCT[17]参照原发性肝癌[15][16,23,26,28]

总有效率

临床总有效率

【参考文献】