犀角地黄汤对局灶性缺血再灌注大鼠自噬水平的影响及其调控机制研究

发布时间：2020-06-27 14:04

【摘要】：目的:探讨中药犀角地黄汤对局灶性脑缺血再灌注大鼠自噬水平的影响,同时研究其具体调控机制,为犀角地黄汤临床治疗缺血性脑卒中提供实验依据以及药理学基础。方法:通过制备大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注大鼠模型(middle cerebral artery occlusi on,MCAO),造模2h后实现再灌注。按随机数字法将造模后的大鼠随机分为6组:假手术组(Sham group),模型组(Model group),犀角地黄汤低剂量组(XJDH,group),犀角地黄汤高剂量组(XJDH-H group),雷帕霉素组(Rapamycin group),犀角地黄汤高剂量+雷帕霉素组(XJDH-H+Rapamycin group)。观察不同时间点的神经功能缺损评分、脑梗死体积比;透射电镜观察神经细胞超微结构及自噬体的相关变化;HE染色及免疫荧光观察脑组织病理形态改变;TUNEL染色观察细胞凋亡:Western blotting检测LC3-Ⅱ,Atg-5、p62等自噬相关蛋白的表达。结果:1.犀角地黄汤对MCAO大鼠神经行为学的影响大鼠造模成功后,于再灌注第1、3、7天时间点,由不清楚分组情况的观察者按照Longa5级评分法进行神经行为评分。其中假手术组大鼠的神经行为学评分为0分,行为学无改变。MCAO模型组大鼠则表现出明显的神经运动功能障碍,二者比较,评分有显著性差异(p=0.000)。其余各组大鼠在术后第1天,神经功能评分较模型组无显著差异(P0.05)。犀角地黄汤干预的各组大鼠在术后第3天及第7天评分较第1天相比均有不同程度的下降(所有P0.05或P0.001),且高剂量组效果更明显。同时犀角地黄汤高剂量组大鼠的神经功能评分低于MCAO模型组(P0.05)。结果表明犀角地黄汤可以不同程度的改善大鼠神经行为学障碍,且高剂量组效果更明显。2.犀角地黄汤对MCAO大鼠脑组织病理学的影响HE染色后,通过光学显微镜下可观察到:假手术组的大鼠脑组织细胞形态规则,排列较为整齐,核仁清晰可见,细胞核无深染固缩。模型组的大鼠脑组织细胞结构改变严重,呈空泡样变,细胞核溶解固缩,同时神经元脱失,多发生在脑缺血中心区,周边皮层未观察到明显神经元脱失情况。雷帕霉素组大鼠的细胞结构破坏及缺血神经元脱失去情况较模型组更为明显。相比之下,犀角地黄汤低剂量组和高剂量组的神经细胞表现为轻度缺血性改变,未发现明显的细胞肿胀坏死及神经元脱失现象。结果表明犀角地黄汤对脑缺血再灌注导致的神经细胞损伤具有明显的改善作用,高剂量的犀角地黄汤效果更加明显。3.犀角地黄汤对MCAO大鼠梗死体积的影响核磁共振检查发现假手术组的脑组织无梗死,MCAO模型组大鼠明显可见脑缺血。除雷帕霉素组,犀角地黄汤干预的各组大鼠在术后第3天及第7天脑梗死体积比较模型组均有不同程度的下降。结果提示雷帕霉素加重脑梗死体积,而不同剂量的犀角地黄汤均能一定程度减少脑缺血体积,同时高剂量组效果更佳。4.犀角地黄汤对MCAO大鼠自噬超微结构的影响电镜下发现假手术组大鼠的神经元细胞内的细胞器丰富,可见有少数溶酶体,线粒体结构清晰,染色质分布正常。模型组和雷帕霉素组海马神经元出现较大的损伤,细胞出现较多空泡,线粒体破碎,溶酶体增加,同时可见双层膜结构的自噬体,内部包含着未降解的细胞器(线粒体)。犀角地黄汤组与模型组相比较,神经细胞核膜的超微结构更加清晰完整,可见细胞内的线粒体轻度肿胀及少数多层的自噬体结构。雷帕霉素联合犀角地黄汤给药组与雷帕组相比较,自噬体明显减少,但自噬体数量较犀角地黄汤高剂量组增多。结果表明犀角地黄汤的脑保护机制可能与减少自噬体的形成相关。5.细胞自噬激活定位运用免疫荧光双标法,在显微镜下可清楚的看到模型组的LC-3Ⅱ、Beclin-Ⅰ呈现为绿色荧光,NeuN为红色荧光。LC-3Ⅱ与NeuN共表达荧光强度最高,LC-3Ⅱ与GFAP的共表达荧光强度较弱,结果提示LC-3Ⅱ主要分布于神经元细胞,而小胶质细胞及神经胶质细胞少见。6.犀角地黄汤对MCAO大鼠脑细胞凋亡的影响通过TUNEL细胞凋亡检测发现,犀角地黄汤给药组凋亡细胞(绿色荧光细胞)数量较MCAO模型组明显减少,进一步说明犀角地黄汤可以减轻神经元细胞损伤,具有神经保护作用。而雷帕霉素组凋亡细胞数量较模型组明显增多,说明雷帕霉素通过诱导自噬进一步加重脑损伤。与犀角地黄汤高剂量组相比,雷帕霉素联合犀角地黄汤治疗组的凋亡细胞数量显著增加,说明雷帕霉素减弱了犀角地黄汤的神经保护作用,间接说明犀角地黄汤抗脑缺血作用与自噬密切相关。7.犀角地黄汤对MCAO大鼠自噬相关蛋白LC3、Atg5、p62的表达及调控自噬分子机制研究实验结果表明,模型组和雷帕霉素组LC3-Ⅱ、Atg5蛋白表达增强,LC3-Ⅱ/LC3-1比值增加,p62表达降低,自噬水平提高。而犀角地黄汤给药组可以下调LC3-Ⅱ、Atg5蛋白表达,提高p62蛋白水平。以上结果表明,犀角地黄汤能够抑制缺血半暗带皮层组织LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化及P62蛋白降解过程,进而减少自噬小体的产生,降低自噬水平,发挥神经保护的作用;自噬诱导剂Rapamycin处理后进一步加重了脑缺血程度,与犀角地黄汤联用能降低犀角地黄汤的神经保护作用。PI3K、mTOR和ERK是LC的上游蛋白,与自噬调控密切相关。模型组大鼠mTOR和PI3K水平降低,ERK磷酸化水平升高,犀角地黄汤可以促进mTOR和PI3K的表达,减低ERK磷酸化。结果表明,犀角地黄汤可能通过促进AKT-mTOR信号通路,抑制ERK磷酸化,从而抑制脑缺血的自噬改善脑缺血再灌注损伤。结论:犀角地黄汤可以改善大鼠的神经行为学,减轻细胞肿胀坏死及神经元的脱失,减少脑梗死体积,减少自噬小体形成,同时发挥神经保护的作用机制与促进AKT-mTOR信号通路,抑制ERK磷酸化,从而抑制自噬相关。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

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自噬体,电镜观察,细胞肿胀

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