抑制动脉粥样硬化中巨噬细胞迁移水蛭肽的药理活性研究

发布时间：2020-06-30 10:55

【摘要】：近年来,心脑血管疾病在全球范围内的发病率及死亡率呈明显上升趋势,其防治工作面临严峻挑战。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性血管炎症性疾病,是心脑血管疾病发生发展的主要病理基础。免疫学说认为巨噬细胞向血管内膜的迁移是AS发生的重要环节,如果能抑制巨噬细胞向受损血管迁移,就能够在对其免疫功能影响较小的情况下,实现AS的早期防治。中药水蛭具有抗凝血、抗血栓和抗炎症等多种活性,临床上已被广泛应用于治疗多种心脑血管疾病。本课题组前期研究发现水蛭酶解物(Hirudo Extraction,HE)可以显著性降低ApoE-/-小鼠主动脉AS斑块面积及斑块中巨噬细胞的数量,其作用机制可能与抑制巨噬细胞向血管内膜下层迁移有关,因此,本课题在上述研究的基础上计划从HE中分离纯化出具有抑制巨噬细胞RAW264.7迁移活性的多肽,并对其作用机制进行研究。主要实验内容及结果如下:1.抑制巨噬细胞RAW264.7迁移水蛭肽的分离纯化与合成本实验采用酶解法从宽体金线蛭中制备得到水蛭酶解物HE。在建立LPS诱导巨噬细胞RAW264.7迁移模型后,通过Transwell小室检测发现HE可以浓度依赖性抑制巨噬细胞迁移。接着使用Q Sepharose FF强碱性阴离子交换柱层析、Superdex 30、Superdex peptide和G10凝胶柱层析对HE进行分离纯化,并结合Transwell实验进行活性追踪,最终分离得到具有抑制巨噬细胞RA3W264.7迁移活性的水蛭肽HE4-1。经HPLC和高分辨质谱检测,水蛭肽HE4-1纯度为98%,分子量为1429.294 Da,氨基酸序列为EAGSAKELEGDPVAG。Transwell实验结果显示800 μg/mL合成水蛭肽HE-D同样具有抑制巨噬细胞迁移活性。2.水蛭肽抑制巨噬细胞迁移作用机制研究研究显示JNK和p38通路参与调节巨噬细胞的迁移。本实验通过Western blot探究HE-D对巨噬细胞JNK和p38蛋白表达的影响,结果显示HE-D对JNK与p38总蛋白的表达量无显著影响,但800 μg/mL的HE-D可以显著抑制由LPS诱导的JNK和p38磷酸化蛋白的升高,这表明HE-D可以通过调节JNK和p38磷酸化水平发挥抑制巨噬细胞迁移作用。3.水蛭肽对巨噬细胞生物学功能影响探究巨噬细胞是机体免疫应答的主要调节细胞。当外源性微生物入侵机体后,巨噬细胞可以通过吞噬、溶解细菌和释放促炎因子调节机体炎症反应。本课题通过中性红吞噬实验、溶菌酶活性测定实验和ELISA实验检测水蛭肽对巨噬细胞免疫相关生物学功能的影响。结果显示0-800 μg/mL的HE4-1和HE-D对巨噬细胞吞噬能力、溶菌酶活性和对IL-1,IL-6,IL-12的分泌能力无显著性影响,但400、800 μg/mL的HE4-1和HE-D可以促进TNF-α的分泌。综上所述,本课题首次从宽体金线蛭干体中分离纯化得到一段序列为EAGSAKELEGDPVAG的多肽HE4-1,该多肽可通过抑制MAPK通路中JNK和p38磷酸化水平发挥抑制巨噬细胞RAW264.7迁移作用。此外,纯化和合成水蛭肽均对巨噬细胞吞噬能力、溶菌酶活性和IL-1,IL-6,IL-12的分泌能力无显著性影响。本课题有可能为中药水蛭在AS早期防治上的应用提供新的理论支持。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：

如本章２．邋１．３．２。逡逑物的制备及抑制巨噬细胞迁移活性检测逡逑备逡逑法从１００邋ｇ宽体金线蛭干体粉末中提取得到水蛭酶Ｅ。逡逑毒性检测逡逑法检测ＨＥ在０－８００邋ｐｇ／ｍＬ范围内对巨噬细胞ＲＡ显示在该浓度范围内，ＨＥ对巨噬细胞的存活率无ＨＥ浓度确定为０＿８０（Ｈｉｇ／ｍＬ。逡逑

３．邋１．３邋ＨＥ抑制巨噬细胞迁移活性检测逡逑３．邋１．３．邋１邋ＬＰＳ诱导巨噬细胞ＲＡＷ２６４．７迁移模型的建立逡逑使用ＬＰＳ诱导建立巨噬细胞ＲＡＷ２６４．邋７徖移模型。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ结果如图２－２逡逑所示，１邋ｐｇ／ｍＬＬＰＳ可显著促进巨噬细胞ＲＡＷ２６４．７的迁移，且迁移细胞数量逡逑适中，便于计数，因此选择该浓度作为ＬＰＳ的最终造模浓度。逡逑：．、，tj＿逦Ｂ逡逑．＇Ｖ邋Ｖ邋：／逦１５０００－，逡逑焌：：媭海Ｉ廔辑詹§逦￡逦＊＊逡逑．ｊ

本文编号：2735224