中药黄荆子木脂素活性成分VN5和VN2抗类风湿性关节炎的作用及机制研究

发布时间：2020-06-30 12:16

【摘要】：研究背景及目的:类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一种以广泛侵袭性的滑膜炎为特征的慢性自身免疫性疾病。在持续的炎症细胞浸润和滑膜细胞增殖的情况下,RA通过破坏关节、软骨和骨骼的结构和功能导致骨侵蚀性破坏、不可逆的关节损伤,甚至造成高度残疾,进而影响患者的健康。天然小分子化合物来源广泛,结构多样,有望成为治疗RA的潜在化学药物。因此,对于寻求具有高效、低毒的的抗RA天然药物显得尤为迫切和重要。黄荆Vitex negundo L.(VN)为马鞭草科牡荆属药用植物,其成熟果实黄荆子是一种民间广泛应用的传统中药,主要功效为祛风除湿和理气止痛,多年来在民间用于治疗RA。已有药理学研究发现其具有抗炎、止痛、抗氧化、抗肿瘤和抗骨质疏松的潜在功效。我们前期研究发现,黄荆子中主要的活性成分为木脂素活性成分(vitexdoins),获得的总木脂素有效部位TOV(total vitexdoins)具有显著的抗RA作用,TOV主要含有4个成分:VNL(VN1)、vitedoin A(VN2)、vitedoamine A(VN5)和vitexdoin A(VN12),但目前对于TOV中有效成分的作用机制均未阐明。因此,本课题选取了其中2个代表性成分VN5和VN2,采用多种炎症及破骨细胞模型研究了VN5和VN2的体外抗RA作用及机制,为TOV候选药物的临床前研究奠定基础。方法:(1)采用CCK8检测了VN5和VN2对293T细胞、RAW 264.7细胞、破骨细胞和成纤维细胞样滑膜细胞的细胞增殖的影响。(2)使用双荧光素酶报告基因法测定了VN5和VN2在293T细胞中对NF-κB的转录活性的抑制作用。(3)采用Griess试剂法测定了VN2,VN5对LPS刺激的RAW 264.7细胞上清液中NO含量的抑制作用。(4)将破骨细胞与不同浓度的VN2、VN5、MCSF(50ng/mL)和RANKL(100ng/mL)共培养4天,至成熟的破骨细胞形成。采用对硝基苯磷酸盐测定成熟破骨细胞中总TRAP活性。(5)用TRAP染色法对成熟破骨细胞进行染色,显微镜观察TRAP阳性细胞数(超过3个细胞核)。除此之外将成熟的破骨细胞用罗丹明缀合的鬼笔环肽染色,并在荧光显微镜下观察肌动蛋白环的结构。(6)利用Western-blot研究了VN5和VN2对LPS/IL-1β/TNF-α刺激的RAW 264.7细胞、RANKL刺激的破骨细胞和IL-1β刺激的成纤维细胞样滑膜细胞中NF-κB和MAPK的炎症信号通路的影响。通过Real-time RT-PCR检测了VN5和VN2对IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等炎症因子和破骨细胞标志性的NFATc1、TRAP、CTSK基因的表达情况。(7)用IKKβ激酶活性光度法检测VN5对RAW 264.7细胞的IKKβ活性的抑制作用;采用分子对接技术初步探究了VN5与其潜在作用靶点IKKβ的结合情况。结果:(1)木脂素活性成分VN5和VN2对不同细胞因子刺激的RAW264.7细胞的抗炎作用及机制研究。VN5可以剂量依赖性地抑制LPS刺激的RAW 264.7细胞中NO的含量,且在此浓度范围内对RAW264.7细胞增殖没有显著性的抑制,同时下调了TNF-α刺激的293T细胞中NF-κB的转录活性(p0.05)。但是,VN2对NF-κB的转录活性和NO含量没有显著的抑制作用。进一步研究发现,VN5通过抑制p-IKK的表达,可进一步下调p-p65和p-ERK的表达,显著抑制LPS/IL-1β/TNF-α诱导的IκB降解,进而抑制了NF-κB和MAPK信号通路的激活(p0.05)。同时,在LPS刺激的RAW 264.7细胞中,VN5显著降低了NF-κB下游炎性细胞因子如IL-1β、IL-6和TNF-α的表达(p0.05)。(2)木脂素活性成分VN5和VN2对破骨细胞形成和功能的影响及作用机制研究。VN2和VN5,较RANKL刺激的模型组相比,均浓度依赖性地显著降低了破骨细胞特征性标志酶TRAP的活性(p0.05)。此外,在破骨细胞分化形成的过程中,模型组中可明显观察到TRAP阳性多核细胞。然而,在VN2和VN5不同剂量给药情况下,尤其是在高浓度时,TRAP阳性多核细胞的数量明显减少(p0.05)。在破骨细胞功能的研究中,肌动蛋白环鬼笔环肽染色结果显示,与对照组相比,VN2和VN5药物处理后肌动蛋白环变细,其周围足体减少甚至消失,且VN2处理后对肌动蛋白环的影响比VN5更明显。因此,本课题进一步探究了其作用机制,发现在RANKL诱导的破骨细胞中,VN2给药后显著抑制了ERK的磷酸化,同时下调了NFATc1,及NFATc1调控的CTSK和TRAP磷酸化的表达,而对NF-κB途径中I?B?和p65的表达没有影响。不同的是,VN5通过下调p-IKK的表达,可同时抑制p-p65和p-ERK以及RANKL诱导的IκB降解,进而抑制了NF-κB和MAPK信号通路的激活(p0.05)。Real-time RT-PCR检测结果表明在VN2和VN5药物组处理RANKL诱导的破骨细胞分化中,NFATc1以及NFATc1调控的CTSK、TRAP和OSCAR的mRNA表达水平显著下降(p0.05)。(3)木脂素活性成分VN5对IL-1β刺激的类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞的抗炎作用及机制和靶点研究。在IL-1β诱导的成纤维细胞样滑膜细胞中,VN5显著抑制了NF-κB下游炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-8的表达(p0.05),在蛋白水平上显著抑制p-IKK的表达,进一步下调p-p65和p-ERK的表达,进而抑制了NF-κB和MAPK信号通路的激活(p0.05)。结合前面的研究结果,我们推测IKK可能是VN5抗RA的潜在靶点。因此,本课题进一步探究了VN5对IKK的作用,发现在LPS刺激的RAW264.7细胞中,VN5处理后显着抑制了IKKβ活性,尤其是浓度为40μM时,抑制率可达48%。同时分子对接结果显示,VN5可与Cys99和Asp103以氢键的形式结合。Cys99位于ATP活性口袋的中心,推测VN5可通过阻止ATP与IKKβ结合,发挥其抑制IKKβ的活性。结论:(1)VN5主要通过抑制炎症反应和缓解骨质破坏发挥抗RA作用,作用机制是通过下调p-IKK蛋白表达,抑制了IκBα降解和p-ERK的蛋白表达,从而抑制NF-?B和MAPK信号通路的激活,IKK?可能是VN5抗RA的作用靶点;(2)VN2主要通过缓解关节骨质破坏发挥抗RA作用,作用机制是通过干预ERK-NFATc1信号通路以及肌动蛋白环的形成来抑制破骨细胞的形成。我们的研究结果提示,黄荆子中的不同木脂素活性成分可协同起效,发挥抗RA作用。
【学位授予单位】：福建中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285

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