基于ROS-自噬通路调控的加味黄芪赤风汤抗AngⅡ诱导的肾小球足细胞损伤机制研究

发布时间：2020-07-01 04:20

【摘要】：目的:慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是指各种原因导致的肾脏损伤和(或)肾小球滤过率(glomerularfiltrationrate,GFR)下降,包括各类肾小球疾病、肾小管间质疾病以及肾血管疾病。CKD已成为世界性的公共健康问题,因此,开展对CKD治疗以及治疗机制的研究具有重要的医学价值和社会意义。足细胞的足突及足突间的裂孔隔膜是肾小球滤过屏障的重要组成部分,足细胞能够产生肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system,RAS)的组分并且表达RAS相关受体,包括血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)、盐皮质激素及其蛋白受体等,足细胞的收缩、凋亡、自噬以及细胞骨架的形成都受到AngⅡ1型受体的调控。活性氧簇(reactive oxide species,ROS)参与自噬的启动及结局过程,自噬能够清除损伤的线粒体以及氧化蛋白,是对ROS造成细胞损伤的重要保护机制,能够缓解细胞损伤。AngⅡ能够提高ROS的表达,通过氧化应激诱导足细胞自噬,抑制氧化应激作用的药物能够抑制自噬水平。前期研究结果显示,加味黄芪赤风汤能够抑制阿霉素诱导的足细胞过度自噬,同时改善阿霉素肾病大鼠肾脏氧化应激损伤,鉴于RAS在肾脏病变中的重要作用,我们建立AngⅡ刺激足细胞损伤模型,探讨加味黄芪赤风汤基于ROS-自噬通路对Ang Ⅱ诱导肾小球足细胞损伤的保护机制。方法:制备加味黄芪赤风汤以及替米沙坦含药血清,CCK-8法检测含药血清对足细胞的毒性作用。AngⅡ分别选用浓度10-8mol/L至10-4mol/L,作用于足细胞24h,采用CCK-8法检测足细胞活性;选用10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L三个AngⅡ浓度,作用于足细胞24h,应用western blot检测足细胞损伤相关蛋白nephrin、podocin的表达,建立AngⅡ足细胞损伤模型。通过western blot检测足细胞损伤相关蛋白nephrin、podocin的表达以及检测自噬相关蛋白LC3、Beclin-1与p62的表达,溶酶体荧光探针检测自噬流活性,透射电镜观察足细胞内自噬体的形成,流式细胞仪检测细胞内活性氧簇ROS的表达,探讨加味黄芪赤风汤通过调控ROS-自噬通路对足细胞的保护作用。结果:1.应用CCK-8法检测足细胞活性,结果显示,加味黄芪赤风汤及替米沙坦含药血清组OD值较空白组略有下降,但各组间OD值比较均无统计学差异(P0.05)。结果表明,加味黄芪赤风汤及替米沙坦含药血清对足细胞无毒性作用。2.建立AngⅡ足细胞损伤模型:应用CCK-8法检测AngⅡ对足细胞活力的影响,结果显示,AngⅡ分别选用浓度10-8mol/L至10-4mol/L,干预足细胞24h后,足细胞活力与空白组相比略有下降,差异无统计学意义(P0.05)。应用western blot检测不同浓度AngⅡ对足细胞损伤相关蛋白nephrin、podocin表达的影响,结果显示,10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/LAngⅡ 均可导致足细胞 nephrin、podocin表达的下降,10-8mol/LAngⅡ组与空白组无明显差异(P0.05);10-7mol/L、10-6mol/LAngⅡ组与空白组相比,差异具有统计学意义(P0.05)。参考文献,AngⅡ浓度在10-6mol/L时,对自噬现象的诱导并不强于10-7mol/L、10-8mol/L,且10-8mol/L AngⅡ不能造成足细胞明显的损伤,结合本实验的目的为探讨加味黄芪赤风汤对AngⅡ诱导足细胞损伤及自噬流的作用,因此,最终选用AngⅡ浓度为10-7mol/L造模。3.AngⅡ能够导致足细胞nephrin、podocin表达的下调,与空白组相比,差异具有统计学意义(P0.01);加味黄芪赤风汤及替米沙坦能够上调nephrin、podocin的表达,加味黄芪赤风汤低剂量组与模型组相比,组间差异无统计学差异(P0.05);加味黄芪赤风汤中剂量、高剂量及替米沙坦组能显著提高nephrin、podocin的表达,与模型组相比,差异具有统计学意义(P0.01)。4.3MA及氯喹可导致足细胞活性降低,与模型组相比,差异具有统计学意义(P0.05);并且,3MA及氯喹可降低足细胞nephrin、podocin的表达,与模型组之间的差异具有统计学意义(P0.05)。5.应用western blot检测足细胞自噬相关蛋白LC3、Beclin-1、p62的表达,结果表明,AngⅡ可上调自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1的表达,下调p62的表达,与空白组相比,差异具有统计学意义(P0.01);加味黄芪赤风汤及替米沙坦则能下调自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin-1的表达,上调p62的表达,与模型组相比(P0.05)。6.透射电镜结果显示:空白组足细胞结构完好,核膜、核仁清晰,细胞器结构正常,存在少量双层膜结构的自噬体。模型组可见双层膜结构的自噬体数量增多,体积增大,自噬体内可包裹有细胞器;加味黄芪赤风汤及替米沙坦含药血清干预后,可见足细胞内自噬体数量减少,并且随加味黄芪赤风汤含药血清浓度增加而减少。结果表明,AngⅡ能够诱导足细胞自噬,加味黄芪赤风汤及替米沙坦能够抑制足细胞自噬,与western blot结果相一致。7.自噬过程中,自噬体需与溶酶体结合才能完成底物的降解,溶酶体与自噬体结合,由初级溶酶体转化为次级溶酶体,酸度升高,从而具有降解内容物的功能,溶酶体荧光探针能够标记酸性溶酶体,反映溶酶体的功能。含药血清干预足细胞后,荧光显微镜下观察溶酶体变化。结果显示,模型组溶酶体功能表达增强,加味黄芪赤风汤及替米沙坦干预后溶酶体表达减弱。结果表明,AngⅡ不仅能够诱导足细胞自噬的启动,而且能够促进自噬体与溶酶体的结合,上调整个自噬流的水平;相反,加味黄芪赤风汤及替米沙坦则抑制整个自噬流的水平。8.流式细胞仪检测足细胞内ROS的表达,与空白组相比,模型组ROS表达增多(P0.01);与模型组相比,加味黄芪赤风汤各剂量组以及替米沙坦组ROS表达减少(P0.05)。结果表明,AngⅡ诱导足细胞ROS的表达,加味黄芪赤风汤下调ROS的表达。结论:1.AngⅡ通过下调足细胞nephrin、podocin的表达,损伤足细胞。2.加味黄芪赤风汤可上调Ang Ⅱ诱导的nephrin、podocin的表达,缓解足细胞损伤。3.Ang Ⅱ诱导的自噬具有保护足细胞的作用,抑制自噬则导致足细胞活性降低。4.加味黄芪赤风汤可能是基于ROS-自噬通路,下调AngⅡ诱导的自噬流,拮抗肾小球足细胞损伤。
【学位授予单位】：中国中医科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

足细胞,含药血清,毒性作用,替米沙坦

按２．３分组，含药血清干预足细胞２４ｈ后，应用ＣＣＫ－８法检测足细胞活性。逡逑结果显示，加味黄芪赤风汤及替米沙坦含药血清组ＯＤ值较空白组略有下降，但逡逑各组间ＯＤ值比较均无统计学差异（Ｐ＞０．０５），见表１，图１。结果表明，加味逡逑黄芪赤风汤及替米沙坦含药血清对足细胞无毒性作用。逡逑表１加味黄芪赤风汤含药血清对足细胞的毒性作用（ｆ邋±＾）逡逑组别逦空白组逦低剂量组逦中剂量组逦高剂量组逦替米沙坦组逡逑ＯＤ邋值逦０．８６士０．０２逦０．８６±０．０２逦０．８５±０．０２逦０．８４±０．０２逦０．８５士０．０３逡逑Ｉ＂逡逑＿＿，＿，＿逡逑图１加味黄芪赤风汤含药血清对足细胞的毒性作用逡逑注：Ｎｏｒｍａｌ：空白组；ＪＷＨＱＣＦＴ－Ｌ：加味黄芪赤风汤低剂量组；ＪＷＨＱＣＦＴ－Ｍ：加味黄芪赤风汤中剂量逡逑组；■ＦＷＨＱＣＦＴ－Ｈ：加味黄芪赤风汤高剂量组；＿Ｔｅｌｍｉｓａｒｔａｎ：替米沙坦组？逡逑３３逡逑

足细胞,活力,自噬,空白

１０＿６ｍｏｌ／Ｌ、３ｘｌ0－６ｍ0ｌ／Ｌ、１０—５ｍｏｌ／Ｌ、３ｘｌ（Ｔ５ｍｏｌ／Ｌ、ｌＣｒｔｎｏｌ／Ｌ，应用邋ＣＣＫ－８邋法检逡逑测Ａｎｇ邋ＩＩ对足细胞活力的影响。结果显示，各浓度Ａｎｇ邋ＩＩ干预足细胞２４ｈ后，足逡逑细胞活力与空白组相比略有下降，差异无统计学意义（Ｐ＞0．0５），见表２，图２。逡逑应用以６５１６１１１１３１0１检测不同浓度八＾１１对足细胞损伤相关蛋白１＾１１１＇丨１１４0＜１0（＾１１表逡逑达的影响，结果显示，ｌ0＿８ｍｏｌ／Ｌ、１０＿７ｍｏｌ／Ｌ、１０－６ｍｏｌ／ＬＡｎｇＩＩ均可导致足细胞逡逑ｎｅｐｈｒｉｎ、ｐｏｄｏｃｉｎ表达的下降，１０＿８ｍｏｌ／Ｌ邋Ａｎｇ邋ＩＩ组与空白组相比无明显差异逡逑（办０．０５）邋；邋１０＿７ｍｏｌ／Ｌ、ｌ0－６ｍｏｌ／ＬＡｎｇＩＩ组与空白组相比，差异具有统计学意义逡逑（尸＜０．０５），见图３。参考文献，Ａｎｇｌｌ浓度在１０＿６ｍｏｌ／Ｌ时，对自噬现象的诱导逡逑并不强于ｌ0－７ｍｏｌ／Ｌ、１０＿８ｍｏｌ／Ｌ［１６，１７］，且１０＿８ｍｏｌ／ＬＡｎｇＩＩ不能造成足细胞明显的逡逑损伤，结合本实验的目的为探讨加味黄芪赤风汤对Ａｎｇ邋ＩＩ诱导足细胞损伤及自噬逡逑流的作用

【参考文献】