丹参酮Ⅰ调控人肝癌7721细胞凋亡机制的研究

发布时间：2020-07-01 05:26

【摘要】：目的:肝癌是我国因癌症引发死亡的第三大杀手。目前针对其治疗方法包括手术疗法(肝切除、肝移植)和非手术疗法(介入疗法、放疗、化疗等),但研究表明大部分肝癌患者会出现术后癌症复发、单纯放化疗效果不明显、容易产生多药耐药、出现强烈药物不良反应等现象。所以临床上急需要寻找一些治疗效果好同时又能够有效降低患者不良反应的药物。我国作为中药发展、研究和应用领域的大国,已经发现有很多天然药用植物的活性提取物具有良好的抗肿瘤疗效,其中丹参酮I就在近年来的报道中被指出抗癌作用明显且毒副作用较低,但其相关作用机制尚不清楚。本实验目的是以人肝癌7721细胞为对象,研究丹参酮I促使细胞凋亡的相关作用机制,为丹参酮I作为抗肿瘤药物进入临床应用提供前期理论和实验基础。方法:以不同浓度剂量丹参酮I刺激细胞,利用倒置显微镜检查细胞形态学变化,CCK8法对各组细胞活力值进行检测,RTCA法实时监测细胞活力变化,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡及细胞内活性氧水平变化情况,同时将细胞用DAPI染色后通过荧光显微镜检测肝癌细胞凋亡情况,应用蛋白免印迹法(WB)检测周期、凋亡及自噬相关蛋白的表达情况,最后再分别利用活性氧清除剂(NAC)和自噬特异性抑制剂(3-MA)预处理细胞后进行细胞活力及细胞凋亡方面的检测。结果:1.丹参酮I能显著抑制人肝癌7721细胞增殖,且呈现时间-剂量依赖性,在倒置显微镜下显示经药物刺激后癌细胞变圆且数量急剧减少。2.丹参酮I可以使人肝癌7721细胞中Cycline A1蛋白的表达量下降,P21的表达量上升,促使细胞被阻滞在S期。3.丹参酮I可以将细胞早期凋亡率由0.24%提高到8.98%,利用DAPI进行核染后随浓度增加荧光亮点数量显著增多,另外可以使P-ERK蛋白表达降低,凋亡标志蛋白分子Caspase3和PRAP表达升高,提示药物可能通过细胞外信号调节激酶途径释放相关信号因子促使细胞发生凋亡。4.丹参酮I刺激癌细胞后可以引发细胞内ROS水平的提高,在加入ROS特异性清除剂NAC孵育,再利用药物刺激细胞后,细胞活力明显上升(P0.001)细胞凋亡率则显著降低(P0.001)。5.丹参酮I可以参与诱导细胞发生自噬,造成自噬标志蛋白LC3-I,LC3-II和Beclin1表达的升高及P62蛋白表达的降低;在利用自噬特异性抑制剂(3-MA)对自噬进行抑制后,细胞活力显著逐渐下降(P0.01),细胞凋亡水平不断提高,提示丹参酮I的加入可能引发细胞内保护性自噬的发生,加入自噬抑制剂后则能够抑制癌细胞的生长。结论:丹参酮I对肝细胞癌具有明显的抗肿瘤活性,可以阻滞细胞周期、促使细胞发生凋亡,是一种潜在的肝癌治疗药物。丹参酮I促使肝癌细胞凋亡的机制可能是刺激癌细胞后通过引起细胞内活性氧水平的增加来有效抑制细胞外信号调节激酶活化,使p-ERK蛋白表达水平降低,同时激活caspase3等凋亡蛋白,进而导致细胞发生凋亡。另外,丹参酮I可以促进肝癌细胞发生保护性自噬,抑制自噬可以增强丹参酮I诱导的细胞凋亡效应,因此当利用药物联合自噬特异性抑制剂使用时可以有效提高药物的抗肿瘤活性,从而进一步提高丹参酮I治疗肝细胞癌的临床疗效。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

肝细胞癌,危险因素

癌概述简介全世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，据全球癌症流行状况统亡率第二位，2012 年共 74.6 万肝癌死亡患者中，有超过 50% 每年全世界约有 25 万人死于原发性肝癌，中国约占其中的 4中排名第四，在肿瘤致死原因中排名第三。原发性肝癌分为肝ular Carcinoma, HCC）、肝内胆管癌（Intrahepatic Cholangiocar肝内胆管混合型癌症（HCC-ICC），其中肝细胞癌占原发性肝细癌多发于男性，在我国肝细胞癌患者男女比率约为 5:1[4]。乙型感染导致了大部分肝细胞癌的发生。另外，黄曲霉素、酗酒、吸和遗传因素等都构成肝细胞癌发生的危险因素，具体相关危险因

肝细胞癌,方法,疗法,患者

手术切除是针对无肝硬化和小肿瘤（实体瘤直径＜3cm），肝功能正常，无门静脉高症患者的首选治疗方式，这种方法可以比较有效的清楚病灶，但可能还存在其他慢性病，据调查这类患者 5 年内肝细胞癌的复发风险为 70%[8]。另外的手术治疗方法是肝植，但往往因缺少合适的肝源成为此种疗法的限制。手术治疗仅适用于早期的肝细胞患者[9]，且这些患者中仅有少于 20%的人适合进行手术治疗[10]。非手术疗法适用于大多数的肝细胞癌患者。其中局部消融术中的射频消融术是最佳疗法之一，它通过医学影像技术对肿瘤进行定位，然后在局部位置对肿瘤进行物理或学杀伤。有报道显示，使用这种方法与手术疗法的患者生存率相当[11]。介入治疗又称ACE 疗法，是在影像学的帮助下使用抗癌药物阻塞肿瘤血管等，从而起到化疗性栓塞用。这两种方法是非手术疗法中目前最常用的办法，一些肝细胞癌化疗药物例如 5-、顺铂、紫杉醇等也能一定程度上提高患者的生存时间，其他疗法例如生物疗法和中疗法可以一定程度上减轻患者的用药不良反应，提高治疗效果，也是目前治疗过程中较常用的手段。

【参考文献】