大叶冬青叶三萜类成分抗乳腺癌作用及质量标准研究

发布时间：2020-07-01 13:07

【摘要】：目的:考察大叶冬青叶三萜类成分体内、外抑制乳腺癌细胞增殖的作用,筛选大叶冬青叶三萜类成分抗乳腺癌的活性成分,探讨其抗乳腺癌的作用机制;对大叶冬青进行质量标准研究,建立HPLC测定大叶冬青叶中多种三萜类成分含量的方法,并结合中药指纹图谱探讨不同产地、不同采收期大叶冬青叶中三萜类成分的含量差异,为大叶冬青叶的质量控制和临床应用提供科学依据。方法:1)采用MTT法比较大叶冬青叶中三萜类成分对人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人宫颈癌Hela细胞增殖的抑制作用。使用流式细胞仪检测27-O-p-(E)-coumaroyl ursolic acid(C-Ur)和大叶冬青叶乙酸乙酯萃取部位(EtoAc-P)诱导MDA-MB-231细胞和Hela细胞凋亡的能力。选用MTT法和流式细胞仪检测不同浓度C-Ur诱导MDA-MB-231细胞凋亡的效果。Wstern-Blot法检测C-Ur体外诱导MDA-MB-231细胞凋亡的相关蛋白的表达和抑制EGFR表达水平。测定不同浓度C-Ur对EGFR酪氨酸激酶的抑制作用,流式细胞仪测定加入siRNA EGFR和Lapatinib的MDA-MB-231细胞中的EGFR表达。体内实验研究给药C-Ur后在无胸腺小鼠体内对肿瘤形成的影响及相关通路的表达。2)建立大叶冬青叶三萜类成分含量定量分析方法,采用HPLC法同时测定大叶冬青叶中地榆皂苷Ⅱ、坡模酸、27-O-p-coumaroyl ursolic acid、胡萝卜苷、3β-Hydroxyurs-11-en-28,13β-olide、乌发醇6种三萜类成分的含量。使用Agilent HC-C_(18)(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以乙腈-0.4%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,检测波长205 nm,柱温30℃,流速1.0 mL/min,进样量10μL。结合中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)软件进行指纹图谱分析。3)采用YMC-ODS C_(18)(4.6 mm×250 mm,5μm)色谱柱,以甲醇-0.4%磷酸水溶液(98:2)为流动相等度洗脱,流速1 mL/min,检测波长205 nm,柱温30℃,进样量20μL,建立同时测定羽扇豆醇、豆甾醇、α-香树脂素含量的方法。结果:1)MTT法检测结果显示大叶冬青叶中C-Ur、(20S,24S)-Epoxydammarane-3β,25-diol、25-Deuteriostigmasteroll、α-amyrin、pomolic acid3-O-α-L-arabinopyranoside、ursolic acid、oleanolic acid、β-sitosterol和β-daucosterol等化合物以及大叶冬青叶EtoAc-P、正丁醇萃取部位对MDA-MB-231细胞和Hela细胞均具有抑制作用,其中C-Ur和EtoAc-P对两种癌细胞的抑制效果最好。流式细胞仪检测出C-Ur诱导MDA-MB-231细胞凋亡的效果强于EtoAc-P,呈剂量依赖型抑制MDA-MB-231细胞增殖,给药的MDA-MB-231细胞中C-caspase-3表达与治疗中MDA-MB-231细胞的凋亡率平行增加,PARP1表达被明显抑制。C-Ur可抑制MDA-MB-231细胞中EGFR的过表达和剂量依赖型抑制EGFR酪氨酸激酶的活性,IC_(50)为56.48 nmol,但对EGFR被抑制的MDA-MB-231细胞无抑制作用。体内实验表明C-Ur可抑制小鼠体内肿瘤生长,下调PI3K/AKT/mTOR和干扰Ras-Raf-MEK-ERK信号通路。2)大叶冬青叶中地榆皂苷Ⅱ、坡模酸、27-O-p-coumaroyl ursolic acid、胡萝卜苷、3β-Hydroxyurs-11-en-28,13β-olide、乌发醇6种三萜类化合物均有良好的分离度,线性范围分别为:4.70~235.00(r=0.999 9),6.94~347.00(r=1.000 0),12.60~630.00(r=0.999 6),36.24~1812.00(r=0.999 9),2.08~104.00(r=0.999 7),28.62~1431.00 mg/L(r=0.999 9),线性关系良好,平均加样回收率在98.18%~102.64%,RSD均小于3%(n=6)。14批同产地不同采收时期大叶冬青叶样品指纹图谱相似度大于0.9,表明样品一致性良好。10批不同产地大叶冬青叶样品指纹图谱相似度较低存在明显差异。3)在上述色谱条件下羽扇豆醇、豆甾醇、α-香树脂素分离度良好,分别在质量溶度18.88~906.00 mg/L(r=1.000 0,n=6)、15.06~723.00 mg/L(r=0.999 9,n=6)、22.75~1092.00 mg/L(r=0.999 9,n=6)呈良好的线性关系,平均加样回收率(n=6)分别为100.43%(RSD=1.96%)、98.72%(RSD=0.88%)、102.86%(RSD=2.47%)。结论:大叶冬青叶中三萜类成分C-Ur在体外能够有效地抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖,促进细胞凋亡。可作为一种EGFR酪氨酸激酶抑制剂下调PI3K/AKT/mTOR和干扰Ras-Raf-MEK-ERK信号通路作用于MDA-MB-231细胞,诱导细胞凋亡。建立的两种HPLC方法均简单方便、结果准确、重复性好,可用于测定大叶冬青叶中多种三萜类成分的含量,结合大叶冬青叶指纹图谱研究可为大叶冬青质量标准的建立提供更加全面的理论依据。且不同产地及不同采收时期大叶冬青叶中三萜类成分含量存在明显差异。
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284.1
【图文】：

细胞凋亡,流式细胞仪检测,细胞,肿瘤细胞凋亡

皖南医学院硕士学位论文α-amyrin >80μM oleanolic acid >80 μM EtoAc-P 5.05 ± 0.48 μg/mL 11.正丁醇部位萃取部位 >80 μg/mL 3.2 流式细胞仪检测 EtoAc-P 和 C-Ur 对肿瘤细胞凋亡的采用Annexinv-FITC/PI双染流式细胞仪检测C-Ur和EtoAc-P对细胞和 Hela 细胞凋亡的影响（药物选取 IC50左右的浓度），计算果表明，C-Ur 和 EtoAc-P 均能够明显促进 MDA-MB-231 细胞和 H并且对 MDA-MB-231 细胞的促凋亡效果明显优于 Hela 细胞，提示有一定的抗肿瘤选择性和特异性（见图 1-1、1-2，见表 1-4、1-5）

M期,细胞凋亡

图 1-2 C-Ur 和 EtoAc-P 对 Hela 细胞凋亡的影响表 1-4 C-Ur 和 EtoAc-P 对 MDA-MB-231 细胞的凋亡影响Ac-P 0 μg/mL 5 μg/mL期凋亡率 6.87% 0.22%期凋亡率 2.36% 42.98%凋亡率 9.23% 43.2%Ur 0 μM 12.5 μM期凋亡率 0.91% 30.43%期凋亡率 0.50% 1.99%凋亡率 1.41% 32.42%表 1-5 C-Ur 和 EtoAc-P 对 Hela 细胞的凋亡率

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