基于Notch信号通路探究补肾益气活血方对绝经后骨质疏松症疗效机制研究

发布时间：2020-07-02 05:47

【摘要】：研究目的探究补肾益气活血方对大鼠骨髓间充质干细胞增殖分化的作用,阐明补肾益气活血方防治绝经后骨质疏松症(Postmenopausal osteoporosis,POP)的疗效机制,为临床防治骨质疏松症提供新的思路,同时为新药的开发提供理论实验基础。材料与方法第一部分:理论研究整理归纳从先秦两汉时期到明清时期古代文献中关于“骨痹”“骨痿”“骨枯”等相关疾病的病因病机及治法方药,并检索现代文献中对骨质疏松症防治病因病机的认识,阐释骨质疏松症理论研究源流。第二部分:体内实验将75只SD雌性大鼠应用切除双侧卵巢法建立大鼠绝经后骨质疏松症模型,实验大鼠随机分为:正常组、假手术组、模型空白组、补肾益气活血组、福善美组,共5组,每组各15只。其中以补肾益气活血方为治疗药物,福善美为对照药物,各组按对应药物灌胃8w,取血清、双侧肾组织及大鼠左后肢股骨,以DAX检测各组大鼠骨密度。应用ELISA法检测各组大鼠血清ALP/TRACP、OPG/RANKL蛋白活性表达,用于评价骨质疏松症大鼠模型建立情况以及药物疗效。应用q RT-PCR法及ELISA法检测骨及肾组织HES1、JAG1和Notch1 m RNA及蛋白活性表达。运用SPSS-17.0对所得数据进行统计分析。第三部分:体外实验1.细胞来源大鼠骨髓间充质干细胞购买于赛业(广州)生物科技有限公司。(产品批号:101113F01)2.实验药物淫羊藿苷:批号200415辽宁北方药检科技开发有限公司黄芪甲苷:批号201314辽宁北方药检科技开发有限公司羟基红花黄色素A:批号201308辽宁北方药检科技开发有限公司地黄苷A:批号XJ0706LA14北京盈泽纳新化工技术研究院鹿茸冻干粉提取物:辽宁清原鹿场3.细胞培养将BMSCs细胞用吸管将细胞悬混液移入100ml培养瓶中复苏后,加入完全培养液(DMEM+10m L/d L胎牛血清含100U/m L青、链霉素)。每日在倒置显微镜中观察细胞生长状态,当细胞大部分贴壁时(80%),用移液管吸出培养液,加入0.25%胰蛋白酶消化3分钟,倒置显微镜下观察细胞逐渐脱落时,加入DMEM(低糖完全培养基)溶液终止消化,用移液管轻轻吹打至悬混液状态,将细胞悬混液移入15m L离心管,1200转/分离心10分钟,去上清后,加入DMEM(低糖完全培养基)调整细胞浓度至1×10~5/m L,按1:3比例接种于25m L细胞培养瓶中将培养瓶放入5%CO_2、37℃的培养箱中培养,每2d传代1次,约传代4次以后开始进行试验。4.实验分组将大鼠骨髓间充质干细胞按5因素3水平正交设计方案分为以下20组正常组(DMEM+10m L/d L胎牛血清含100U/m L青、链霉素)成骨转化组(DMEM+10 m L/d L胎牛血清含100 U/m L青、链霉素+1×10~(-7)mol/L地塞米松+50 g/L维生素C+10 mmol/L B-甘油磷酸钠)1组:淫羊藿苷1鹿茸1黄芪甲苷1羟基红花1地黄12组:淫羊藿苷1鹿茸2黄芪甲苷2羟基红花2地黄23组:淫羊藿苷1鹿茸3黄芪甲苷3羟基红花3地黄34组:淫羊藿苷2鹿茸1黄芪甲苷1羟基红花2地黄25组:淫羊藿苷2鹿茸2黄芪甲苷2羟基红花3地黄36组:淫羊藿苷2鹿茸3黄芪甲苷3羟基红花1地黄17组:淫羊藿苷3鹿茸1黄芪甲苷2羟基红花1地黄38组:淫羊藿苷3鹿茸2黄芪甲苷3羟基红花2地黄19组:淫羊藿苷3鹿茸3黄芪甲苷1羟基红花3地黄210组:淫羊藿苷1鹿茸1黄芪甲苷3羟基红花3地黄211组:淫羊藿苷1鹿茸2黄芪甲苷1羟基红花1地黄312组:淫羊藿苷1鹿茸3黄芪甲苷2羟基红花2地黄113组:淫羊藿苷2鹿茸1黄芪甲苷2羟基红花3地黄114组:淫羊藿苷2鹿茸2黄芪甲苷3羟基红花1地黄215组:淫羊藿苷2鹿茸3黄芪甲苷1羟基红花2地黄316组:淫羊藿苷3鹿茸1黄芪甲苷3羟基红花2地黄317组:淫羊藿苷3鹿茸2黄芪甲苷1羟基红花3地黄118组:淫羊藿苷3鹿茸3黄芪甲苷2羟基红花1地黄2注:1—低浓度:10~(-8)mol/L;2—中浓度:10~(-7)mol/L;3—高浓度:10~(-6)mol/L(鹿茸低1μg/ml;中10μg/ml;高100μg/ml)5.指标检测实验四MTT法检测各组BMSCs 24h、48h、72h增殖情况。ELISA法检测各组细胞6d、9d、12d ALP蛋白活性表达茜素红染发法观察各组细胞6d、9d、12d矿化结节情况实验五q RT-PCR法检测各组细胞9d、12d HES1、JAG1及Notch1 m RNA表达ELISA法检测各组BMSCs 9d、12d HES1、JAG1及Notch1蛋白活性表达6.数据处理采用SPSS17.0统计软件处理实验数据,所有数据以(?)±s表示,体内实验各组数据均用单因素方差分析,体外实验部分各组均数采用正交设计方差分析,各组间均数比较运用最小显著差数法(LSD)法,P0.05具有统计学意义。结果第一部分:理论研究中医骨质疏松症属“骨痹”“骨痿”“骨枯”等范畴,发病病机与肾精亏虚、脾胃亏损、肝郁血虚及瘀血阻络四个方面相关,其中以肾精亏虚最为根本。治疗上应当审症求因,辨证论治,兼顾标本,采用补肾健脾、补肝养血、活血化瘀等治疗方法,发挥中医整体观念和辨证施治的优势。第二部分:体内实验1.补肾益气活血方对去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨密度变化情况的影响与正常组相比较,模型空白组左后肢股骨骨密度显著降低(P0.01),假手术组密度未见明显变化(P0.05);与模型空白组相比较,各治疗组骨密度均有不同程度的升高(P0.01),其中福善美组骨密度升高最明显,补肾益气活血组其次(P0.05)。2.补肾益气活血方对去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨形成、骨吸收的影响与正常组相比较,假手术组血清ALP含量未见明显差异(P0.05),模型空白组血清ALP含量明显减少(P0.01);与模型空白组相比较,各用药组血清ALP含量均明显增加(P0.01),其中福善美组优于补肾中药组(P0.01)。与正常组相比较,假手术组血清TRACP含量未见明显变化(P0.05),模型空白组血清TRACP含量明显升高(P0.01);与模型空白组相比较,各用药组血清TRACP含量明显降低(P0.01),福善美组与补肾益气活血组血清TRACP含量未见明显差异(P0.05)。3.补肾益气活血方对去卵巢骨质疏松症模型大鼠血清OPG/RANKL蛋白活性表达情况的影响与正常组相比较,假手术组血清OPG未见明显差异(P0.05),模型空白组血清OPG明显减少(P0.01);与模型空白组相比较,各用药组血清OPG均明显增加(P0.01),福善美组与补肾益气活血组血清OPG未见明显差异(P0.05)。与正常组相比较,假手术组血清RANKL未见明显差异(P0.05),模型空白组血清RANKL明显升高(P0.01);与模型空白组相比较,各用药组血清RANKL均明显降低(P0.01),福善美组与补肾益气活血组血清RANKL未见明显差异(P0.05)。4.补肾益气活血方对去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨组织及肾组织HES1 m RNA及蛋白活性表达情况的影响骨组织:与正常组相比较,模型空白组HES1 m RNA及蛋白活性表达含量明显减少(P0.01);与模型空白组相比较,各用药组HES1 m RNA及蛋白活性表达均明显增加(P0.01),福善美组HES1 m RNA含量与补肾益气活血组未见明显差异(P0.05),HES1蛋白表达优于补肾益气活血组(P0.01)。肾组织:与正常组相比较,模型空白组HES1 m RNA及蛋白活性表达明显减少(P0.01);与模型空白组相比较,各用药组HES1 m RNA及蛋白活性表达明显增加(P0.01);福善美组与补肾益气活血组HES1 m RNA及蛋白活性表达未见明显差异(P0.05)。5.补肾益气活血方对去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨组织及肾组织JAG1 m RNA及蛋白活性表达情况的影响骨组织:与正常组相比较,模型空白组JAG1 m RNA含量明显减少(P0.01);与假手术组相比较,模型空白组JAG1 m RNA及蛋白活性表达明显减少(P0.01);与模型空白组相比较,各用药组JAG1 m RNA及蛋白活性表达增加(P0.01),福善美组JAG1 m RNA及蛋白活性表达高于补肾益气活血组(P0.01)。肾组织:与正常组相比较,模型空白组JAG1 m RNA及蛋白活性表达明显减少(P0.01);与模型空白组相比较,各用药组JAG1 m RNA及蛋白活性表达均明显增加(P0.01);福善美组与补肾益气活血组JAG1 m RNA相对表达量未见明显差异(P0.05),福善美组JAG1蛋白活性表达高于补肾益气活血组(P0.01)。6.补肾益气活血方对去卵巢骨质疏松症模型大鼠骨组织Notch1 m RNA及蛋白活性表达情况的影响骨组织:与正常组相比较,模型空白组Notch1 m RNA及蛋白活性表达显减少(P0.01);与模型空白组相比较,各用药组Notch1 m RNA及蛋白活性表达明显增加(P0.01),福善美组Notch1 m RNA表达高于补肾益气活血组(P0.01),两者间Notch1蛋白活性表达未见明显差异(P0.05)。肾组织:与正常组相比较,模型空白组Notch1 m RNA及蛋白活性表达明显减少(P0.01);与模型空白组相比较,各用药组Notch1 m RNA及蛋白活性表达均明显增加(P0.01);福善美组与补肾益气活血组Notch1 m RNA及蛋白活性表达未见明显差异(P0.05),福善美组Notch1蛋白含量高于补肾益气活血组(P0.01)。第三部分:体外实验1.补肾益气活血方正交组分配伍对BMSCs增殖的影响各组BMSCs24h增殖比较,与正常组比较第1、3、4、7、8、9、10、11、13组BMSCs增殖未见显著差异(P0.05),其余各组增殖情况均有显著上升(P0.01);与转化液组比较各组均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组组间比较发现第18组BMSCs增殖显著高于其他各组(P0.01)。各组BMSCs 48h增殖比较,与正常组比较第1、3、5、7、8、9、11、12、13组BMSCs增殖未见显著差异(P0.05),其余各组增殖情况均有显著上升(P0.01);与转化液组比较第17、18组未见显著差异(P0.05),其余各组均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组组间比较发现第17、18组BMSCs增殖显著高于其他各组(P0.01)。各组BMSCs 72h增殖比较,与正常组比较,转化液组,第15、16、17组BMSCs增殖未见显著差异(P0.05),其余各组增殖情况均有显著差异(P0.01);与转化液组比较第10、12、13、15、16、17组未见显著差异(P0.05),其余各组均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组组间比较发现第16、17、18组BMSCs增殖显著高于其他各组(P0.01)。正常组、转化液组及16、17、18组均于48h到达增殖峰值(24h vs 48h P0.01,48h vs 72h P0.01)。2.补肾益气活血方正交组分配伍对BMSCs成骨分化的影响各组细胞6d ALP:与正常组比较,第1、2、3、5组未见显著差异(P0.05),其余各组ALP表达均显著升高(P0.01);与转化液组比较各组均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组间比较发现,第16、18组ALP蛋白活性表达最高(P0.01)。各组细胞9d ALP:与正常组比较各组ALP蛋白活性均显著增高(P0.01);与转化液组比较各组均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组间比较发现,第16、18组ALP蛋白活性表达最高(P0.01)。各组细胞12d ALP:与正常组比较,第2组未见显著变化(P0.01),其余各组ALP蛋白活性均显著增高(P0.01);与转化液组比较,第16、18组未见显著差异(P0.05),其余各组均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组间比较发现,第16、18组ALP蛋白活性表达高于其余各组(P0.01)。正常组、转化液组及16、18组9d ALP活性表达均高于6d(P0.01);正常组、转化液组及16、18组12d ALP活性表达均高于12d(P0.01)。3.补肾益气活血方正交组分配伍对各组细胞9、12d HES1 m RNA及蛋白活性表达的影响9d:与正常组比较,第13、15、17组HES1 m RNA表达未见显著差异(P0.05),而各组HES1蛋白活性表达与正常组比较均有显著差异(P0.01);与转化液组比较,第16组HES1 m RNA未见显著差异(P0.05),而各组蛋白活性表达与转化液组均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组组间比较发现第16、18组上调9d HES1 m RNA及蛋白活性表达作用最佳(P0.01)。12d:与正常组比较各组12d HES1 m RNA表达均有显著差异(P0.01);与转化液组比较各组均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组组间比较发现第18组上调12d HES1 m RNA表达作用最佳(P0.01)。各组蛋白活性表达与正常组比较均有显著差异(P0.01);与转化液组比较各组均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组组间比较发现第18组上调12d HES1蛋白活性表达作用最佳(P0.01)。正常组9d与12d HES1 m RNA表达未见明显差异(P0.05);转化液组、16组及18组12d HES1 m RNA表达显著高于9d(P0.01)。正常组、16组与18组9d、12d HES1蛋白活性表达未见显著差异(P0.05);转化液组12d HES1蛋白活性表达显著高于9d(P0.01)。4.补肾益气活血方正交组分配伍对各组细胞9、12d JAG1 m RNA及蛋白活性表达的影响与正常组比较,第17组9d JAG1 m RNA表达未见显著差异(P0.05),而各组9d JAG1蛋白表达与正常组比较均有显著差异(P0.01);与转化液组比较各组JAG m RNA及蛋白活性表达均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组组间比较发现第17、18组上调9d JAG1 m RNA表达作用最佳(P0.01),第17组上调9d JAG1蛋白活性表达最佳(P0.01)。与正常组比较各组12d JAG1 m RNA及蛋白活性表达均有显著差异(P0.01);与转化液组比较各组12d JAG1 m RNA及蛋白活性表达均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组组间比较发现第7、11、12组上调12d JAG1 m RNA及蛋白活性表达作用最佳(P0.01)。正常组9d与12d JAG1 m RNA表达未见明显差异(P0.05);转化液组、7、11、12、17、18组12d JAG1 m RNA表达显著高于9d(P0.01)。正常组和转化液组9d JAG1蛋白活性表达显著高于12d(P0.01),7、11、12、17、18组12d JAG1蛋白活性表达显著高于9d(P0.01)。5.补肾益气活血方正交组分配伍对各组细胞9、12d Notch1 m RNA及蛋白活性表达的影响与正常组比较,第1、4、5、6、7、8、9组9d Notch1 m RNA未见显著差异(P0.05),而各组9d Notch1蛋白表达与正常组比较均有显著差异(P0.01);与转化液组比较各组9d Notch1 m RNA及蛋白活性表达均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组组间比较发现第16、17、18组上调9d Notch1 m RNA表达作用最佳(P0.01),第11组上调9d Notch1蛋白活性表达作用最佳(P0.01)。与正常组比较各组12d Notch1 m RNA及蛋白活性表达均有显著差异(P0.01);与转化液组比较各组12d Notch1 m RNA及蛋白活性表达均有显著差异(P0.01);各中药正交组分配伍组组间比较发现第15组上调12d Notch1 m RNA表达作用最佳(P0.01),第1、9组上调12d Notch1蛋白活性表达作用最佳(P0.01)。正常组9d与12d Notch1 m RNA表达未见明显差异(P0.05);转化液组、15、16、17、18组9d与12d Notch1 m RNA表达有显著差异(P0.01)。正常组及转化液组12d Notch1蛋白活性表达较9d显著降低(P0.01);1、9、11组12d Notch1蛋白活性表达较9d显著升高(P0.01)。6.补肾益气活血方有效成分最佳配伍方案实验结果表明最佳配伍为A_3B_1C_1D_1E_1,即淫羊藿苷(10~（-6）mol/L高剂量)鹿茸冻干粉提取物(1μg/ml低剂量)黄芪甲苷(10~（-8）mol/L低剂量)羟基红花黄色素A(10~(-8)mol/L低剂量)地黄苷A(10~(-8)mol/L低剂量)。结论1.中医骨质疏松症属“骨痿”“骨枯”等范畴,发病病机与肾精亏虚、脾胃亏损、肝郁血虚及瘀血阻络四个方面相关,其中以肾精亏虚最为根本。治疗上常采用补肾健脾、补肝养血、活血化瘀等治疗方法,本研究基于导师临床经验,并综合文献研究,建立补肾益气活血方进行防治研究。2.补肾益气活血方可以提高骨质疏松症模型大鼠骨密度,增加大鼠骨形成,抑制骨吸收,运用补肾益气活血中药复方防治骨质疏松症有很好的疗效。3.补肾益气活血方通过上调骨质疏松症大鼠OPG表达,抑制RANKL表达,起到维持骨健康、改善骨代谢作用。4.补肾益气活血方通过上调骨质疏松症大鼠骨与肾组织HES1、JAG1及Notch1 m RNA及蛋白活性表达,从而起到防治绝经后骨质疏松症的作用。5.补肾益气活血方正交组分配伍最佳方案为淫羊藿(10~(-6)mol/L高剂量)鹿茸冻干粉提取物(1μg/ml低剂量)黄芪甲苷(10~(-8)mol/L低剂量)羟基红花黄色素A(10~(-8)mol/L低剂量)地黄苷A(10~(-8)mol/L低剂量)。6.补肾益气活血方正交组分配伍组均能够促进BMSCs增殖及成骨分化,其作用机制与上调Notch信号通路中HES1、JAG1以及Notch1 m RNA及蛋白活性表达有关。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：

后肢,股骨,图像,补肾益气

图 1.2 双能 X 线检测各组左后肢股骨图像举例.1 各组大鼠左后肢离体股骨骨密度比较例数骨密 14 0.1组 12 0.1组 11 0.1血组 10 0.1组 12 0.1＜0.05，**P＜0.01；与假手术组比较：△P＜0.05，△△P＜0.01；与补肾益气活血组◇P＜0.05，◇◇P＜0.05。0.20.25**△△**☆☆☆

信号通路,途径,配体

h 配体也是 I 型跨膜蛋白，在果蝇体内发现了 2 种同源物 Delta 和 Se内配体为 Lag2，故 Notch 配体又称为 DSL（Delta-Serrate-Lag-2）膜蛋物体内发现的 Notch 配体与 Delta 同源性高的称为 Delta-like，与 S的称为 Jagged。目前在人体内发现的 Notch 配体有 Delta-like1、3、2。配体胞外的 DSL 结构域是活化 Notch 受体，促使受体与配体结 Notch 信号所必需的。h 通路的效应分子 CSL 与 HES，CSL 是转录抑制因子，它通过招募 S组蛋白去乙酰化酶等蛋白形成共抑制复合物，抑制下游基因的转基因编码属于碱性螺旋-环-螺旋转录因子（basic-helix-loop-helix，bH1、HES2。HES 的碱性结构域与 DNA 相结合，通过 HLH 结构域的介H 形成二聚体发挥其效应[101]。哺乳动物体内 Notch 通路效应分子ES5 发挥作用[102]。

【参考文献】