芒果甙通过激活JAK2-STAT3及ERK通路上调小鼠脾脏单个核细胞IL-10表达的研究

发布时间：2020-07-03 04:06

【摘要】：目的:我们的前期实验已证明芒果甙(mangiferin,MA)可上调小鼠脾脏单个核细胞(mononuclear cells,MNCs)中调节性B细胞(regulatory B cells,Bregs)和白细胞介素10(interleukin 10,IL-10)水平,本次研究在此基础上,进一步探究MA上调Bregs和IL-10的分子机制,为MA运用于慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host disease,cGVHD)防治提供分子依据。方法:通过颈椎脱臼法处死雄性BALB/c小鼠后,用红细胞裂解液分离出小鼠脾脏MNCs。首先检验MA是否可以激活JAK2-STAT3、ERK、及TLR4-MyD88三条信号通路,在此部分研究中,实验分组如下:(1)DMSO对照组;(2)实验组:用不同浓度MA(50uM、100uM、150uM、200uM)干预小鼠脾脏MNCs,用Western blot法检测各组细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、ERK、p-ERK、TLR4、MyD88等分子的蛋白表达量,用RT-PCR检测各组细胞中TLR4的转录水平。然后,分别在抑制剂存在的条件下,验证MA激活以上信号通路是否影响Bregs增殖分化和IL-10的分泌,实验分组如下:(1)DMSO对照组;(2)200uM MA组;(3)200uM MA+抑制剂组(JAK2激活抑制剂AG490,或STAT3激活抑制剂HO3867,或ERK激活抑制剂U0126),在证明抑制剂有效的前提下,用ELISA检测各组细胞培养上清液中IL-10的浓度,用流式细胞术检测各组细胞中Bregs的比例。结果:1、MA通过激活JAK2-STAT3信号通路促进IL-10表达,但Bregs的增殖分化不受该信号通路影响:(1)MA激活JAK2-STAT3信号通路。与对照组相比,MA呈剂量依赖性促进p-JAK2、p-STAT3蛋白表达,尤以200uM MA组增高最明显(P=0.000,P=0.008),但不影响JAK2、STAT3的蛋白表达(P0.05)。(2)AG490、HO3867可抑制MA对JAK2-STAT3信号通路的激活作用。Western blot结果显示,与MA组相比,MA+抑制剂组(AG490或HO3867)p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达量显著减少(AG490:P_(p-JAK2)=0.043,P_(p-STAT3)=0.016;HO3867:P_(p-STAT3)=0.001)。(3)AG490、HO3867抑制MA上调MNCs中IL-10表达的作用。ELISA结果显示,与MA组相比,MA+抑制剂组(AG490或HO3867)IL-10的浓度明显降低(AG490:P=0.0057;HO3867:P=0.0333),但流式细胞术结果显示两组Bregs水平并无差异(P0.05)。2、MA通过激活ERK信号通路促进小鼠MNCs中负性调节因子IL-10的蛋白表达水平,但Bregs的增殖分化不受该通路影响:(1)MA上调ERK通路水平。与对照组相比,各组MA均可显著提高p-ERK的蛋白水平(P=0.045、0.016、0.103、0.047),但不影响ERK的蛋白表达(P0.05)。(2)U0126抑制MA对ERK的磷酸化。Western blot结果显示,与MA组相比,MA+U0126组p-ERK蛋白表达量显著减少(P=0.0079)。(3)U0126抑制MA对MNCs细胞IL-10分泌的促进作用。ELISA结果显示,与MA组相比,MA+U0126组IL-10的水平明显降低(P=0.0046),但流式细胞术显示的Bregs水平两组之间并无差异(P0.05)。3、MA可能通过激活TLR4-MyD88信号通路,促进小鼠MNCs中Bregs增殖和IL-10产生:(1)RT-PCR结果显示,与对照组相比,MA明显上调了MNCs中TLR4的转录水平(P=0.042、0.114、0.02、0.031);Western blot结果也显示,MA可促进MNCs表达TLR4(P=0.049、0.09、0.003、0.001)、MyD88(P_(100uM)=0.036)。结论:本研究对既往实验结果进行了补充和延伸,证实MA通过激活JAK2-STAT3和ERK两条信号通路上调小鼠脾脏MNCs中IL-10的表达,这为MA可能发挥的抗cGVHD作用提供了分子依据;然而,本次研究并未发现MA促进Bregs增殖的分子机制,以及芒果甙的体内活性等一系列问题也有待进一步深入研究,以期为cGVHD的防治提供新的治疗方案。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

20图 1. MA 激活小鼠脾脏 MNCs 中 JAK2-STAT3 信号通路注：小鼠脾脏 MNCs 在 DMSO 组及不同浓度 MA（50uM、100uM、150uM、200uM）组的条件下培养 72h，用 Western Blot 法检测细胞中 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表达水平，MA 组 p-JAK2、p-STAT3 的蛋白表达水平均明显升高，而JAK2、STAT3 的表达水平较对照组无明显变化。*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001,MA v.s. DMSO

华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文图 2. JAK2 激活抑制剂 AG490 可抑制 MA 对 JAK2-STAT3 的激活作用注：小鼠脾脏 MNCs 分别在 DMSO、200uM MA、及 200uM MA+50uM AG490条件下体外培养 72h，用 Western Blot 法检测细胞中 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3 蛋白表达水平。 *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, MA v.s. DMSO,MA+AG490 v.s. MA

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