白花蛇舌草抗炎作用研究与miRNA高通量测序

发布时间：2020-07-03 07:37

【摘要】：目的:探究白花蛇舌草对炎症的治疗作用;初步探讨白花蛇舌草在固有免疫方面可能的抗炎作用机制,为临床治疗提供实验依据;对白花蛇舌草中已知microRNA(miRNA)进行鉴定与分析,并预测所含新miRNA,为后续蛇舌草miRNA及靶基因调控表达在抗炎机制方面的研究提供依据。方法:用二甲苯致小鼠耳肿胀模型。选昆明种小鼠随机分成空白组、阳性对照组(阿司匹林),白花蛇舌草水提物低、中、高剂量组,白花蛇舌草醇提物低、中、高剂量组共8组。连续灌胃7d,末次给药1h后,在小鼠右耳两面涂以100%二甲苯30微升,左耳对照,30min后处死,沿耳郭基线剪下左右耳,用打孔器(半径4mm)制备耳片,以两耳重量差作为炎症指标,研究白花蛇舌草的抗炎作用。选用SD大鼠,随机分成模型组、阳性对照组(阿司匹林),白花蛇舌草水提物低、中、高剂量组,白花蛇舌草醇提物低、中、高剂量组共8组,保证无菌条件,水合氯醛麻醉后作腹部切口,将已称重的棉球植入大鼠两腹沟股部皮下。受试药物当天给予,连续12d,最后一次给药1h后将大鼠处死,完整剥离棉球肉芽组织,于75℃烘箱内干燥24h后称重,减去原棉球重量,即为肉芽肿净重。比较各组肉芽重量,计算抑制率。先应用“寇氏法”进行LD_(50)测定~([1]),然后建立小鼠脓毒症模型:模型组小鼠称重后,腹腔注射LD_(50)剂量LPS(0.2ml/10g),阴性对照组和中药对照组给予等量生理盐水。将小鼠随机分为空白对照组、模型组、地塞米松干预组和白花蛇舌草水提组、醇提组。地塞米松干预组、水提组、醇提组连续灌胃7d,其余各组给予等体积生理盐水;末次给药30min后,除空白组外,其余各组小鼠腹腔注射LPS(10mg/kg)造模,空白组给予等体积生理盐水,1次/d持续至实验结束。分别于造模后6h、12h、24h、48h进行临床症候观察,酶联免疫吸附法(ELISA)检测小鼠血清炎症因子白介素-6(IL-6)、白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平。颈椎脱臼法处死小鼠,观察各组织病理变化,并统一切取肝左上叶,置于10%中性福尔马林溶液中固定后,制成5μm厚的石蜡切片,光镜下观察小鼠肝脏组织病理学变化。Trizol法提取白花蛇舌草总RNA,经琼脂糖凝胶电泳、TGem微量分光光度计及Agient 2100 Bioanalyzer检测总RNA纯度及完整性。然后构建白花蛇色草smallRNA文库,以Unigene为参考序列,将获得的Clean read与Gene、Rfam、miRNABase21.0以及Repbase数据库比对,得到已知miRNA及其表达量,未比对上的序列用于新miRNA的预测分析。结果:耳肿胀实验结果显示,白花蛇舌草水提物、乙醇提取物均对二甲苯诱导的小鼠耳肿胀有明显的抑制作用。其中水提取物高剂量组,醇提物低剂量组和中剂量组抑制效果明显。肉芽肿实验结果显示,白花蛇舌草水提中、高剂量组,醇提低、中剂量组对大鼠棉球所致肉芽肿有明显的抑制作用。LPS脓毒症实验结果显示,白花蛇舌草提取物组小鼠肝脏组织损伤程度明显轻于模型组,并且水提组损伤减轻更明显;与同时间节点模型组比较,白花蛇舌草水提组和白花蛇舌草醇提组小鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平明显降低(P0.05)。组内比较,白花蛇舌草提取物组12h节点对上述指标的改善均明显优于6h节点,并且与白花蛇舌草醇提取物组相比,白花蛇舌草水提取物组各时间节点作用效果较好,但无显著性差异。琼脂糖凝胶电泳结果显示,白花蛇舌草总RNA的18S、28S条带清晰完整,亮度比值接近2;Agient 2100 Bioanalyzer质检结果显示OD_(260nm)/OD_(230nm)值处于1.8-2.1,OD_(260nm)/OD_(280nm)值处于2.0-2.3,28S/18S1.0,RIN7.0,满足RNA高通量建库标准。通过高通量测序,最终鉴定出白花蛇舌草中含115个已知miRNA,分属于16个miRNA家族。表达丰度最高的miR166、miR157、miR2911、miR167、miR168等miRNA家族的表达量均超过50000。结论:白花蛇舌草提取物能有效抑制小鼠耳肿胀、大鼠棉球所致肉芽肿,其中水提物浓度为3g/kg时抑制作用最为明显;醇提物浓度为125mg/kg时抑制作用最为明显。白花蛇舌草提取物能够有效改善LPS脓毒症小鼠的肝损伤,减轻小鼠的临床症状;能有效抑制IL-6、IL-1β、TNF-α水平,其作用机制可能是通过抑制此相关炎症因子的表达,调节固有免疫系统的平衡而发挥作用。成功提取了符合高通量测序的白花蛇舌草总RNA及构建smallRNA文库,鉴定白花蛇舌草所含microRNA的种类及表达量,证实新鲜白花蛇舌草中富含microRNA。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

图 4-1 各组小鼠肝组织病理变化（HE 染色，×200）ig. 4-1 Pathological changes of liver tissue in each group (HE staining, ×200)肝脏肝小叶结构完整，肝细胞以中央静脉为中心向四周呈放射状排胀、变性或坏死。模型组小鼠肝细胞可见明显肿胀、变性，排列紊细胞边界及细胞核模糊不清，有炎性细胞浸润，肝细胞脂肪样变性，胞凋亡，24h 后，病变情况逐渐好转。白花蛇舌草提取物组和阳性模型组明显减轻，肝小叶结构较清晰，少数肝细胞有轻微水肿，其异常变化（见图 4-1）。的触发剂，其后有多参与 SIRS 的最初启动，其中 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 为最有影同时机体产生的内源性免疫炎性因子会形成“瀑布效应”，危重病人性抗炎反应能力降低以及代谢功能紊乱，最易引发 SIRS，严重者可

图 5-2 各组小鼠血清中炎症因子 IL-6 水平含量Figure 5-2 Serum levels of inflammatory cytokines IL-6 in each group of mice 白花蛇舌草提取物对脓毒症模型小鼠血清中 IL-1β 水平的影响.1 IL-1β 标准品浓度曲线的建立

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本文编号：2739386