蜜炙黄芪有效部位的分离及其抗炎活性研究

发布时间：2020-07-03 12:49

【摘要】：黄芪是我国传统中医药中的常用滋补中药材,其蜜炙品具有比生品更高的补中益气、调节免疫作用,临床常用蜜炙黄芪替代生品黄芪以提高其免疫调节等方面的疗效。本研究旨在建立蜜炙、生品黄芪有效部位的分离纯化方法,以及通过脂多糖(LPS)诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞炎症模型探讨蜜炙、生品黄芪有效部位的体外抗炎活性。实验根据蜜炙、生品黄芪有效部位(多糖、黄酮、皂苷)极性的差异分别进行分离。采用凝胶色谱法对蜜炙、生品黄芪多糖进行纯化,通过HPLC-ELSD的方法研究蜜炙、生品黄芪多糖的分子量范围,通过柱前衍生化以及UPLC/Q-TOF MS技术结合面积归一化法对蜜炙、生品黄芪多糖的组成单糖种类与含量进行分析;采用Poly-sery HLB固相萃取法分离纯化蜜炙、生品黄芪黄酮部位与皂苷部位,应用UPLC/Q-TOF MS技术结合面积归一化法检测黄酮、皂苷有效部位的化学成分和相对含量;建立LPS诱导的小鼠RAW264.7炎症细胞模型,考察蜜炙、生品黄芪有效部位的细胞毒性以及对细胞因子释放的调控,从而探讨其对细胞相关炎症因子表达的影响。蜜炙黄芪多糖分子量为298847,组成单糖种类及含量(nmol)之比为甘露糖∶葡萄糖∶木糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖醛酸∶鼠李糖=0.06∶28.34∶0.58∶0.24∶0.33∶0.21。生品黄芪多糖分子量为309687,组成单糖种类及含量(nmol)之比为甘露糖∶葡萄糖∶木糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖醛酸∶鼠李糖=0.27∶12.83∶1.63∶0.71∶1.04∶0.56。蜜炙黄芪黄酮部位与皂苷部位含量分别为96.59%与95.06%,包括4种黄酮类成分与12种皂苷类成分。结合本课题组前期实验研究结果可知,黄芪蜜炙后总黄酮含量降低而总皂苷含量增加,即蜜炙后总黄酮的含量下降,尤其毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷-6"-O-丙二酸酯的含量锐减,而毛蕊异黄酮苷与黄芪总皂苷的含量有所增加。蜜炙、生品黄芪各有效部位给药浓度在100μg/mL以内对小鼠RAW264.7细胞均无明显细胞毒性作用,从抑制炎症细胞的NO与细胞因子释放情况来看,蜜炙、生品黄芪有效部位均具有抗炎活性,且蜜炙黄芪有效部位的活性普遍强于生品黄芪有效部位。通过比较蜜炙黄芪各有效部位对细胞因子释放的抑制结果可知,蜜炙黄芪皂苷部位的抗炎活性最强,其次是蜜炙黄芪黄酮部位,最后是蜜炙黄芪多糖部位。黄芪蜜炙后多糖中葡萄糖的含量急剧增高而其余单糖的含量则有减小,提示黄芪蜜炙有利于葡萄糖的增加,原因可能为炼蜜中含有的大量葡萄糖在蜜炙过程中与黄芪多糖结合,加热过程可能造成部分多糖的分解从而导致其余单糖含量的降低。蜜炙后总皂苷类的含量有所升高而总黄酮含量降低,提示黄芪蜜炙有利于其皂苷类成分的溶出,加热过程可能造成某些基团的丢失而产生一些化合物含量的变化。蜜炙黄芪有效部位较生品黄芪有效部位能更好地抑制炎症细胞中细胞因子NO、IL-1β、TNF-α的释放,推测可能由于蜜炙黄芪有效部位与生品黄芪有效部位有效成分含量以及组成的差异从而引起抗炎活性的差异。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;R285.5
【图文】：

柱分离,负离子,标准品,葡萄糖醛酸

鼠李糖 y = 6.4915x - 22.234 R2= 0.996142.4.5 蜜炙黄芪多糖的单糖组成分析在考察分析条件时，比较了不同的分析色谱柱对单糖衍生化产物的分离分析效果，通过比较了 HILIC 亲水柱、BEH C18 色谱柱与 HSS T3 色谱的分离效果，最终确定本实验所采用的 Kinetex 1.7 μm EVO C18 柱。根据不同条件下的总离子流图可知，当流动相中含有少量酸时，峰形与峰响应强度能得到改善。流动相 A 中加入少量乙酸铵则能更加良好的改善峰形。所以，经过反复试验，最终确定的流动相为 0.1%甲酸水-10mM 乙酸铵，以梯度洗脱的方式，能将 6 个单糖衍生产物分离开来。其中，1 号峰为甘露糖，2 号峰为鼠李糖，3 号峰为葡萄糖醛酸，4 号峰为葡萄糖，6 号峰为阿拉伯糖。由图 2-1 可知，所有单糖衍生化产物均能在 7 分钟之前出峰。尽管在总离子流图上看，葡萄糖醛酸和葡萄糖并没有被分开，但通过提取离子的方式可知（如图 2-2 所示），葡萄糖醛酸与葡萄糖仍能被分辨出来。

相图,葡萄糖醛酸,离子液,相图

葡萄糖醛酸、甘露糖、葡萄糖的提取离子液相图谱

【参考文献】