猴头菌丝体多糖对小鼠溃疡性结肠炎的影响及其抗炎机制研究

发布时间：2020-07-03 21:31

【摘要】：溃疡性结肠炎(UC)是一种炎症性肠道疾病,全球发病率不断增加,研究发现其发生、发展与炎症密切相关。猴头菇是药食两用真菌,传统应用于治疗消化道疾病。基于猴头菌对胃肠道的保护作用,本课题尝试从猴头发酵菌丝体中分离纯化得到猴头多糖,对多糖的抗炎活性和治疗小鼠UC的效果进行评价,并探究其作用机制。主要研究工作如下:(1)猴头发酵菌丝体中多糖的分离、纯化和结构初步表征。首先将猴头菌丝体粉末经水提醇沉、除蛋白后得到猴头粗多糖,总糖含量为89.1%,凝胶渗透色谱结果显示猴头粗多糖的重均分子量(Mw)为22.3 kDa(8.60%)、18.7 kDa(61.77%)、2.2 kDa(29.63%)。因此进一步选择离子交换柱DEAE-Sepharose Fast Flow和葡聚糖凝胶柱Sephadex G-75分离纯化,得到单一组分HEP10(polypolysaccharides of Hericium erinaceus 10),其Mw为9.9 kDa,是由葡萄糖(69.2%)、半乳糖(14.7%)、鼠李糖(5.2%)、木糖(4.7%)、氨基半乳糖(2.0%)、甘露糖(1.7%)、岩藻糖(1.6%)、氨基葡萄糖(0.9%)8种单糖组成的杂多糖。IR、1H NMR和13C NMR结果显示HEP10是由α和β型糖苷键连接的吡喃糖组成,推测糖苷键连接方式为(1→2)和(1→6)。(2)HEP10体外抗炎活性评价。通过1μg/mL脂多糖(LPS)作用于巨噬细胞RAW264.7建立体外炎症模型,将不同浓度HEP10作用于炎症细胞模型20 h,考察HEP10的抗炎活性。结果发现,浓度为12.5-400μg/mL HEP10作用细胞,对细胞存活率无显著影响。当HEP10浓度为50-200μg/mL时,其对NO分泌产生了明显的抑制作用,同时抑制白细胞介素(IL)-1β、肿瘤坏死因子(TNF)-α的分泌,并下调TNF-α、IL-1β基因转录水平,对IL-6分泌及其mRNA表达没有显著影响。25-200μg/m LHEP10能够显著下调由LPS刺激的细胞中诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)和环氧合酶(COX)-2的表达,抑制炎症小体胱冬肽酶(Caspase)-1、NOD样受体(NLRP)3、凋亡相关微粒蛋白(ASC)的激活;Western Blot结果显示,HEP10显著下调NF-κB、PI3K/Akt和MAPK信号通路中相关蛋白的磷酸化水平,抑制信号通路激活。(3)HEP10治疗葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠UC的机制研究。采用2%DSS诱导C57BL/6小鼠建立UC动物模型,评价HEP10对小鼠UC的治疗效果。结果显示,与模型组相比,不同剂量HEP10(50、100和200 mg/kg/d)治疗组均能改善小鼠体重下降、疾病指数评分增加的情况,结肠长度分别增长了23.7%、29.1%和40.9%。病理切片结果显示,HEP10(50、100和200 mg/kg/d)治疗组小鼠的结肠中炎性细胞浸润现象改善,隐窝与腺体结构完整,病理炎症程度减轻。氧化应激相关指标显示,治疗组小鼠中血清NO含量分别下降13.4%、26.5%和36.4%,结肠丙二醛(MDA)水平分别下降了21.4%、47.3%和56.4%,同时结肠髓过氧化物酶(MPO)的酶活降低,总超氧化物歧化酶(T-SOD)的酶活明显增加。qRT-PCR和Western Blot显示,HEP10(50、100和200 mg/kg/d)降低小鼠结肠中炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌及其mRNA的相对表达水平,下调炎症蛋白i NOS和COX-2的表达量,抑制炎症小体NLRP3、ASC和Caspase-1的激活并下调NF-κB、PI3K/Akt和MAPK中相关蛋白的磷酸化水平,从而抑制炎症相关信号通路的激活。综上所述,猴头多糖HEP10具有抗炎活性,可以改善小鼠UC的炎症症状,其作用机制可能是通过抑制氧化应激反应改善组织损伤,并抑制炎症小体激活,下调炎症相关信号通路中蛋白的磷酸化水平,调控炎症因子基因转录,降低炎症因子和蛋白的表达量,从而减缓组织炎症的发展。
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

标准曲线,总糖含量,苯酚-硫酸法,标准曲线

HECP)，得率为18.2%。2.4.2 猴头粗多糖中总糖含量葡萄糖标准曲线如图2-1所示，利用苯酚-硫酸法测定多糖样品中总糖含量，带入标准曲线计算可得，猴头粗多糖中总糖含量为89.1%。

标准曲线,蛋白含量,标准曲线,蛋白

图 2-1 苯酚-硫酸法测总糖含量的葡萄糖标准曲线 2-1 Glucose standard curve by Phenol - Sulfuric Acid m白含量蛋白，随着次数增加，蛋白含量降低，同时多vage 试剂重复三次除蛋白，既可最大程度去除利用 Bradford 法测定蛋白含量，标准曲线如图粗多糖中蛋白含量为 6.3%。

【参考文献】