栀子苷调控S1P-S1PR1及其下游RhoA-F-actin-NF-кB信号通路干预成纤维滑膜细胞对血管内皮细胞生物学功

发布时间：2020-07-07 01:22

【摘要】：第一部分条件培养基的制备及其对人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)生物学功能的影响目的:体外培养MH7A,建立肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)诱导MH7A炎症损伤模型,制备来自MH7A的条件培养基。确定MH7A条件培养基诱导HUVEC的适宜浓度,并观察MH7A条件培养基对HUVEC生物学功能的影响及其产生作用的机制。方法:MH7A体外成功培养后,用浓度为2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL的TNF-α作用促进其增殖。CCK-8法检测TNF-α作用后MH7A的增殖活性以确定适宜的造模浓度。造模24 h后,提取MH7A培养液,并且从澄清度、无菌、pH值等方面对提取的培养液进行质量评价。HUVEC体外成功培养后,HUVEC经过不同浓度MH7A条件培养基诱导后,CCK-8法检测不同组HUVEC增殖活性以确定MH7A条件培养基诱导HUVEC的适宜浓度。采用条件培养基和普通培养基分别对实验组和对照组诱导24 h,采用CCK-8法、细胞划痕、细胞迁移法观察HUVEC增殖和迁移活性的变化,ELISA法检测HUVEC上清中血管紧张素-1(Angiotensin,Ang-1)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor,FGF)和血管抑素(Angiostatin,AS)分泌量、蛋白质电泳法(Western-blot)法和RT-qPCR检测HUVEC中S1P-S1PR1及其下游RhoA-F-actin-NF-κB信号通路中关键蛋白S1PR1、RhoA、F-actin、NF-κB p65等的蛋白及mRNA表达量。结果:浓度为5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的TNF-α均都能诱导MH7A增殖,10 ng/mL的TNF-α为造模的适宜浓度。提取的培养基为粉红色的澄清透明溶液,无菌、pH值为7.28±0.12,该溶液pH在多数细胞培养的适宜值(7.2-7.4)。CCK-8结果证明MH7A条件培养基原液、二倍及四倍稀释液均能诱导HUVEC增殖,在后续实验部分均采用MH7A条件培养基原液作为刺激物。经MH7A条件培养基诱导后,HUVEC增殖和迁移能力显著增加。HUVEC中促血管生成因子Ang-1、FGF分泌量升高,抑血管生成因子AS分泌水平下降,使促/抑血管生成因子动态平衡向促进血管新生方向移动。Western blot法检测S1PR1、RhoA、F-actin、NF-κB p65和NF-κB p-p65的蛋白表达量均上升。RT-qPCR检测HUVEC中S1PR1、RhoA、F-actin和NF-κB p65的mRNA表达量明显增加。结论:成功制备来自于MH7A的符合细胞培养基本要求的条件培养基。来自MH7A的条件培养基可成功诱导HUVEC增殖和迁移。MH7A条件培养基具有促进HUVEC血管新生的作用,其作用机制是通过活化S1P-S1PR1及其下游RhoA-F-actin-NF-κB信号通路实现的。第二部分栀子苷(Geniposide,GE)对MH7A条件培养基诱导的HUVEC生物学功能改变的治疗作用目的:探讨经GE给药后对条件培养基诱导的HUVEC生物学功能改变的治疗作用及其作用机制。方法:HUVEC经MH7A条件培养基诱导24 h,加入浓度为6.25μM、12.5μM、25μM、50μM、100μM、200μM的GE溶液作用24 h后,CCK-8法检测HUVEC的增殖活性以确定GE适宜给药浓度。采用细胞划痕、细胞迁移法观察给药后HUVEC迁移能力的变化,ELISA法检测HUVEC上清中Ang-1、FGF和AS分泌量、荧光染色法观察HUVEC中F-actin的形态和分布、Western-blot法和RT-q PCR检测MH7A条件培养基诱导的HUVEC中S1P-S1PR1及其下游Rho A-F-actin-NF-κB信号通路中关键蛋白S1PR1、Rho A、F-actin及NF-κB p65的蛋白表达量及RNA表达量。结果:经GE给药后,HUVEC的异常增殖反应得到抑制,且浓度为25μM、50μM、100μM的GE溶液作用较为显著。故以上三个剂量被用于之后的实验。且HUVEC增加的增殖活性和迁移能力均被GE显著抑制。HUVEC中失去动态平衡的促/抑血管生成因子得到改善,不同程度下调促血管生成因子Ang-1和FGF水平,上调抑血管生成因子AS水平。Western blot和RT-q PCR法检测S1PR1、Rho A、F-actin及NF-κB p65上升的蛋白和m RNA表达量均明显下调。结论:GE明显改善MH7A条件培养基对HUVEC的诱导作用,并且其作用机制是通过抑制S1P-S1PR1和下游RhoA-F-actin-NF-κB信号通路实现的,这些新的发现有助于我们进一步阐明GE在抑制类风湿关节炎血管新生和细胞骨架重组等方面的作用机制。
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：

统计学方法,滑膜细胞,适宜浓度,信号通路

调控 S1P-S1PR1 及其下游 RhoA-F-actin-NF-κB 信号通路干预成纤维滑膜细胞对血管内皮学功能影响t = (Ct,gene1-Ct,GAPDH) sample1 - (Ct,gene1-Ct,GAPDH) sample2 统计学方法采用 SPSS 23.0 软件处理数据，均数±标准差（Mean SD）表示量平均值，组间差异采用 t 检验，p<0.05 表示组间具有显著性差异。验结果不同浓度 TNF-α对 MH7A 增殖的影响以每孔 5×103的细胞密度将 MH7A 接种于 96 孔培养板中，为了确定的适宜浓度，用浓度为 2.5 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、40F-α诱导 MH7A，CCK-8 试剂检测 MH7A 的增殖活性。结果表明，5 /mL、20 ng/mL 的 TNF-α溶液均能促进 MH7A 增殖，后续选择的造为 10 ng/mL（图 1）。

条件培养基

的制备及其对人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endo生物学功能的影响的条件培养基可以满足细胞培养所需的基本条件为之后继续观察 MH7A 条件培养基能否影响 H其治疗作用创造了条件。基中 S1P 含量的测定细胞培养上清于离心管，以 1800 rpm 的转速离1P 活性的检测。如图 2，与正常组相比，模型组著增高，结果证明炎性环境可以明显增加 MH7。

条件培养基,细胞迁移,划痕宽度,划痕法

H7A 条件培养基对 HUVEC 细胞划痕的影响胞划痕法检测 HUVEC 迁移能力。将 HUVEC 制成浓度为于六孔板内，待 HUVEC 铺满底部时，用灭菌的 200μL 的痕，使细胞间形成刮沟，用 PBS 冲洗掉滑落细胞后，加少下拍照，记为 0 h。加入 MH7A 条件培养基或正常培养基后微镜下拍照，记为 24 h。细胞迁移能力的大小用划痕宽度度变化程度愈大，则表示细胞迁移能力愈强。模型组 HUV明显高于空白组，这表明 MH7A 条件培养基可显著诱导力。图 3 不同浓度的 MH7A 条件培养基对 HUVEC 增殖能力的影响Fig. 3 Proliferation of HUVEC treated by TNF-α##P<0.01 vs Ctr (mean±SD，n=6)

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