基于流动注射化学发光对重楼皂苷类化合物的分析研究

发布时间：2020-07-07 02:27

【摘要】：本研究以秦巴山区野生中药材重楼,又名七叶一枝花Paris polyphylla var.chinensis(Franch.)Hara为供试材料,通过乙醇回流提取皂苷,经分离纯化工艺制备样品;利用流动注射-化学发光(CL-FIA)分析技术,构建了重楼皂苷类化合物和重楼皂苷Ⅰ单体的分析检测方法。通过条件及参数优化,方法学验证和干扰试验;并结合HPLC和UV分析结果比较,考察了CL-FIA的灵敏度和可行性。主要研究内容和实验结果分述如下。(1)在重楼皂苷类提取的单因素试验基础之上,采用响应面法优化重楼皂苷类的提取工艺;同时,利用大孔吸附树脂对重楼皂苷成分进行纯化。在优化最佳条件下,通过HPLC或UV检测分析结果显示,样品中重楼皂苷类化合物含量分别为21.938mg·g~(-1)和22.192mg·g~(-1)。此外,在提取纯化重楼皂苷的基础上,采用硅胶柱层析技术分离获得重楼皂苷Ⅰ单体成分,HPLC分析检测表明,皂苷Ⅰ含量为2.068~2.098mg·g~(-1)之间,其纯度为95.40%。分析结果表明,所构建的重楼皂苷提纯方法和皂苷Ⅰ单体的分离工艺条件可行,从而为后续重楼皂苷类成分的CL-FIA分析研究奠定了基础。此外,通过HPLC对15批来源不同的市售重楼药材样品,对7种皂苷类化合物的含量进行了分析,构建了HPLC指纹图谱。结果表明,测定的样品中甾体皂苷种类和含量差异较大,品质良莠不齐。(2)试验研究表明,在Luminol-H_2O_2体系中,H_2O_2通过氧化Luminol产生较弱强度的化学发光,但加入Cu2+后对该化学发光强度有增敏作用;在该体系中加入重楼皂苷后,可明显抑制化学发光。在酸性介质中,重楼皂苷对KMnO4-Luminol体系的化学发光有明显的抑制作用。据此,基于Luminol-H_2O_2和KMnO4-Luminol化学发光体系,构建了重楼皂苷的CL-FIA分析检测方法。试验分别以重楼皂苷Ⅶ、Ⅰ和薯蓣皂苷为标品,开展了对比检测。在优化的条件下,Luminol-H_2O_2体系中,3种标品对该体系的线性范围分别是0.305~3.050μg·mL~(-1),0.308~3.080μg·mL~(-1)和0.311~3.110μg·mL~(-1);检出限分别为0.202μg·mL~(-1),0.224μg·mL~(-1)和0.215μg·mL~(-1);测定样品中重楼皂苷化合物的含量为21.003mg·g~(-1),RSD≤1.68%。在KMnO4-Luminol体系中,3种标品对该体系的线性范围分别是0.140~2.330μg·mL~(-1),0.142~2.353μg·mL~(-1)和0.144~2.376μg·m L~(-1);检出限分别为0.102μg·mL~(-1),0.135μg·m L~(-1)和0.125μg·mL~(-1),测定样品中重楼皂苷化合物的含量为21.248mg·g~(-1),RSD≤1.78%。采用以上2种体系,分别以3种标准品开展平行分析检测,其结果无明显差异;通过建立的体系与方法,对标品溶液平行检测11次,RSD均小于2.98%,表明精密度良好。比较CL-FIA与HPLC或UV对重楼皂苷的测定结果表明,3种不同分析检测方法的测定结果基本一致,讨论了方法的可行性和可靠性。此外,2种发光检测体系精确度的比较显示,KMnO4-Luminol-H+体系的检测范围较宽、其检出限更低、灵敏度较高。(3)通过对化学发光体系的配体、反应介质种类、介质浓度和仪器参数等因素的试验考察,筛选出2种化学发光体系可用于测定重楼皂苷Ⅰ单体的CL-FIA方法,同时探讨了方法的可行性。在不同的介质条件下,重楼皂苷Ⅰ对Ce(Ⅳ)-罗丹明6G体系的发光强度有较大的增强作用,而对Luminol-NaIO4发光体系则有明显的抑制作用。在优化反应条件下,2种体系的线性范围分别为1.275~4.250μg·mL~(-1)和0.855~4.250μg·mL~(-1);检出限分别为0.793μg·mL~(-1)和0.697μg·mL~(-1);基于2种体系对样品中重楼皂苷Ⅰ的分析检测,其含量分别为1.938mg·g~(-1)和1.956mg·g~(-1)。综合比较分析表明,2种化学发光检测体系,Luminol-NaIO4体系对重楼皂苷Ⅰ的检测结果相对令人满意;但CL-FIA测定重楼皂苷Ⅰ的精确性略低于HPLC。研究表明,CL-FIA检测结果的影响因素较多,其中发光剂和氧化剂的影响作用比较显著。不同化学发光体系、不同系统设定参数、不同组分浓度等多方面,均会影响样品的检测结果。所以,针对不同药材或药材的不同活性成分的测定,筛选适宜的化学发光体系是构建CL-FIA方法的关键所在;其次,其精确性和灵敏度与反应介质的种类、浓度以及仪器参数等的设定与优化也有一定的关系。通过纵横向比较分析,研究结果表明,本实验所建立的流动注射-化学发光分析检测重楼皂苷成分的方法,其精确度比UV或HPLC略低。但CL-FIA方法具有线性范围宽,检测限低,分析速度快,实验成本较低等优点,故该方法为重楼药材的品质分析、皂苷类成分的检测或质控方面提供了另一依据和途径。
【学位授予单位】：陕西理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284.1
【图文】：

标准曲线,重楼,皂苷,标准曲线

计算重楼皂苷Ⅶ、H、Ⅵ、3.0%。率% =加标试样测定值-试样测定值加标量曲线的建立立别精密吸取对照品溶液，于 0.05，0.1，挥干，再依次加入 10.0 mL 高氯酸后冷水浴至室温，以甲醇溶液为空白对照值(Y) 为纵坐标，重楼皂苷Ⅶ浓度(X，为 Y = 0.0412X－0.0016, R2= 0.9975。00μg·mL-1范围内与吸光度呈良好的线性

重楼,皂苷,薯蓣皂苷

加甲醇定容，然后用 0.22μm 滤膜过滤，依次进样 20.0μL 进行色谱分析，定峰面积。分别以各色谱峰面积(Y)为纵坐标，以对照品质量浓度(X)为横坐标，进线性回归，绘制标准曲线。保留时间、线性回归方程、相关系数和线性范围(表 2表 2-1 重楼对照品线性回归方程及相关系数Table 2-1 Regression equation and rorrelation coefficient of reference substances solution重楼皂苷成分保留时间/min 线性回归方程 R2线性范围/μg·m重楼皂苷Ⅶ 3.50 Y=5129.7X+158933.1 0.9991 9.2-184重楼皂苷 H 4.22 Y=7929.6X+201886 0.9994 9.6-192重楼皂苷Ⅵ 4.86 Y=13422X+65055 0.9990 9.2-184重楼皂苷Ⅱ 7.95 Y=5628.4X+19827 0.9991 12.8-256薯蓣皂苷 9.47 Y=6265.1X+18166 0.9994 8.7-174重楼皂苷Ⅰ 10.57 Y=6708.5X+40102 0.9993 9.2-184重楼皂苷 V 13.24 Y=6875.7X+44.6 0.9995 9.4-188

浸泡时间,乙醇,提取溶剂,皂苷

表 2-2 提取溶剂对皂苷得率的影响Tab. 2-3 Effect of extraction solvent on yield取剂30%乙醇 50%乙醇 70%乙醇 90%乙醇 100%乙醇 50%甲醇 100%甲醇率/%1.601 1.792 1.854 1.790 1.715 1.688 1.715(2) 提取前浸泡时间固定提取溶剂(70%乙醇)，固定液料比 30:1(mL:g)，水浴提取温度(85℃)，提取时(60min·次-1)及提取次数(1 次)，分别考察在溶剂中冷浸时间为 30，60，90，120 和0min 的提取效果。结果表明，选择浸泡时间为 90min 较为适宜(图 2-3)。(3) 液料比固定提取溶剂(70%乙醇)，其它条件同(1)项，考察液料比为 10:1，20:1，30:1，:1，50:1 和 60:1(mL:g)对重楼皂苷得率的影响。结果表明，选择液料比为 40:1(mL:g)，果最佳(图 2-4)。

【参考文献】