左归丸胚胎期干预对高脂血症模型孕鼠子代IGT的预防作用及其机制研究

发布时间：2020-07-07 08:11

【摘要】：目的研究考察左归丸干预高血脂模型孕鼠对其子代糖耐量减低(IGT)易感蛋白表达的影响及其机制,以明确左归丸干预母代是通过何种方式对子代IGT易感蛋白的表达产生长远的有利影响,并进一步预防或延缓子代IGT的发生。方法将SD大鼠随机分为4组(每组雌12,雄6),即正常对照组,模型对照组,胰岛素(4mg·kg~(-1))组,左归丸(10g·kg~(-1))组。模型组和胰岛素组以及左归丸干预组雌鼠采用高脂饲料喂饲法以创造高血脂环境。造模成功后雌雄2:1合笼过夜,孕鼠于第三天(P3d)开始给药,胰岛素组按4mg·kg~(-1)肌肉注射给药,左归丸组按10g·kg~(-1)灌胃给药,正常对照组和模型对照组给予生理盐水,灌胃组大鼠均按20mL·kg~(-1)给药,1日1次,至P19d(预产期)。待F0代孕鼠分娩F1代鼠后,称取F1代鼠体重,每窝F1代子鼠各保留12只(6♂,6♀),组别不变,并从第五周开始每周称量F1代各组大鼠体重。从第10周开始每周对各组大鼠进行一次糖耐量负荷试验(先测空腹血糖,继之2g·kg~(-1)的葡萄糖灌胃,2h后检测血糖水平),待模型对照组大鼠出现IGT(餐后血糖水平7.8-11.2mmol/L)后,处死各组大鼠,取血清适量,组织灌注后取胰腺、肝脏等组织,采用HE染色观察各组大鼠肝脏和胰脏的病理病变情况;采用iTRAQ(isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation)技术对差异蛋白进行筛选;采用RT-PCR技术对与IGT密切的差异蛋白进行mRNA表达水平检测;采用ELISA法检测差异蛋白信号通路相关指标;进一步从差异蛋白信号通路的角度探讨左归丸胚胎期干预对IGT模型大鼠IGT遗传易感基因以及差异蛋白表达状况的影响及机理。结果1.与正常对照组比较,高脂血症诱导的模型对照组子代(F1代)大鼠出生后不同时间体重显著或极显著降低(~*P0.05,~(**)P0.01);与模型对照组比较,胰岛素组和左归丸组出生后不同时间体重显著或极显著增加(~#P0.05,~(##)P0.01)。2.与正常对照组比较,模型对照组的血脂四项(TC、TG、HDL、LDL)水平和血糖水平(空腹及餐后)显著或极显著升高(~*P0.05,~(**)P0.01);与模型对照组比较,胰岛素组和左归丸组的血脂四项水平和血糖水平出现不同程度的改善(~#P0.05,~(##)P0.01)。3.与正常对照组比较,模型对照组的肝脏和胰脏组织病理切片显示脂肪样改变、组织瘀血以及胰岛细胞萎缩;与模型对照组比较,胰岛素组和左归丸组的脂肪样改变、组织瘀血以及胰岛细胞萎缩有所缓解。4.蛋白组学分析显示增殖蛋白激酶-3(ERK1)与糖代谢密切相关,是IGT差异蛋白;与正常对照组比较,模型对照组的ERK1水平显著降低(P0.05);同模型对照组比较,胰岛素组和左归丸组的ERK1水平显著降低(P0.05)。5.同正常对照组比较,模型对照组F1代大鼠ERK1的m RNA表达水平显著上调(~*P0.05);同模型对照组比较,胰岛素组和左归丸组F1代大鼠ERK1的mRNA表达水平无显著差异。6.同正常对照组比较,模型对照组的血清Beta2、INS、INSR、PI3K表达水平显著或极显著升高(~*P0.05,**P0.01),IRS1表达水平显著下降(~*P0.05)。同模型对照组比较,胰岛素组的Beta2、PI3K表达水平显著下降(~#P0.05),IRS1表达水平显著升高(~#P0.05),但INS、INSR的表达水平未见显著降低;同模型对照组比较,左归丸组的INS、INSR、PI3K表达水平显著下降(~#P0.05),IRS1表达水平显著升高(~#P0.05),但Beta2的表达水平未见显著降低。结论左归丸胚胎期干预可以对高血脂环境出生F1代大鼠IGT的发病产生一定的防治作用,其机制可能是:机体自身多种蛋白之间共同作用,抑制ERK1整条同路的最终表达结果。左归丸滋补肾阴,胚胎期的干预对胎儿产生了表观遗传修饰作用,体内达到另外一种形式的阴阳平衡,强化了胎儿对宫内不良环境的适应能力,降低了高糖高脂环境对胎儿的不良影响,降低F1代大鼠后天IGT发病的风险。同时验证了中医“肾藏精”、“主生殖”、“主生长发育”以及“阴平阳秘,精神乃治”的基本理论。
【学位授予单位】：山西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5;R-332
【图文】：

A5注：(A1:0w A2:5w A3:9w A4:13w A5:15w)与正常对照组比较*P < 0.05，**P < 0.01；与模型对照组比较#P < 0.05，##P < 0.01图 1 左归丸胚胎期干预对高脂血症模型大鼠 F1 代不同时间体重的影响2.2 左归丸胚胎期干预对高脂血症模型大鼠 F1 代血糖的影响

E3 E4注：（ E1: 正常对照组 E2: 模型对照组 E3: 胰岛素组 E4: 左归丸组）图 5 F1 代大鼠胰脏病理切片图（HE 染色，×200 倍）

(从左至右) 正常对照组，模型对照组，胰岛素组，左归丸组。（如图 1）图 1 样本抽提总蛋白的 SDS-PAGE 胶图1.3.2 蛋白的还原烷基化（1）从每个样本中等量取出 300ug 蛋白，体积上的差距用裂解液补齐。（2）加入终浓度 5mM DTT 还原二硫键，30℃反应 30min。（3）冷却至室温后加入 25mM IAM，封闭游离巯基，室温避光反应 45min。（4）加入 10 倍体积-20℃预冷丙酮沉淀蛋白，-20℃静置过夜。（5）20000g 4℃离心 10min，弃去上清，加入-20℃预冷 80%丙酮漂洗，-20℃静置 1h。（6）同样方式，加入预冷丙酮漂洗两次，离心去上清。（7）蛋白沉淀室温放置 10min

【参考文献】

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本文编号：2744875