刺梨黄酮对阿霉素所致心肌细胞自噬和凋亡的影响

发布时间：2020-07-07 11:37

【摘要】：背景阿霉素(Doxorubicin,DOX)用于临床上常见恶性肿瘤的治疗,作用广谱,效果显著,然而其心肌毒性作用,使患者的生活质量下降,限制了在临床上的使用。其引发心肌毒性的信号通路较多,包括细胞自噬和凋亡。刺梨果实中含有丰富的黄酮,平均含量6.8g/kg,最高达8g/kg。研究发现,这种果实中的黄酮成分具有抗氧化、保护心脏血管的作用,但对于阿霉素引起的心肌毒性是否具有保护作用知之甚少。本研究通过培养心肌细胞,探讨刺梨黄酮对阿霉素引起心肌毒性时自噬及凋亡的调节作用及机制。目的探讨刺梨黄酮(Flavonoids of Rosa roxburghii Tratt,FRRT)对阿霉素(DOX)引起心肌细胞自噬和凋亡的影响及其机制。方法采用原代分离培养出生1-3d的新生大鼠心肌细胞和H9C2心肌细胞株,应用浓度为5μmol/L的阿霉素孵育心肌细胞,建成心肌细胞毒性模型组,并用刺梨黄酮提前进行干预,通过透射电子显微镜察看各组H9C2心肌细胞株超微结构。使用免疫荧光和Western Blotting技术检测自噬有关基因(LC3-II、P62)、凋亡有关基因(Bax、P53和Bcl-2)的具体分布和表达,并应用Image J及Grapf Pad Prism 5软件对Western Blotting检测的结果,进行半定量分析。结果1.形态学观察1.1 DOX组细胞生长状态不良,大多细胞缩小且呈现高折光的圆形。Control组细胞生长状态良好,细胞形态大多呈现长梭形,心肌细胞规律搏动。FRRT组,只可见部分细胞缩小呈高折光的圆形状态,大多数仍是长梭形。1.2透射电镜观察显示DOX组细胞内呈现大量的自噬泡和脂褐素,各种细胞器结构模糊不清,细胞状态差;FRRT干预后,心肌细胞未见脂褐素的结构,只有少量自噬泡的出现,各种细胞器结构清晰可见。2.免疫荧光检测2.1自噬相关蛋白检测显示,LC3-II在DOX组中大量表达在细胞核周围,Control组中LC3-II表达不明显,FRRT组中散在表达在细胞质中;P62在DOX组中只有极个别细胞质中表达,Control组中在大多数心肌细胞胞质中表达明显,FRRT组中部分细胞表达P62。阴性对照组未见LC3-II、P62的阳性表达。2.2凋亡相关蛋白检测显示,Bax在DOX组细胞质中均匀表达,Control组及FRRT组中未检测到明显表达;P53在DOX组细胞核中呈点状大量表达,Control组中表达不明显,FRRT组中呈点状少量表达;Bcl-2在DOX组细胞核周围胞质中少量表达;Control组和FRRT组在细胞核周围胞质中表达明显。阴性对照组未见Bax、P53、Bcl-2的阳性表达。3.Western Blotting检测3.1自噬相关蛋白检测显示,LC3-II在DOX组中表达较Control组、FRRT组显著增加,组间比较,差异具有统计学意义(**P0.01),FRRT组与Control组相比略增加,组间比较,差异不具有统计学意义(P0.05);P62在DOX组中表达较Control组、FRRT组减少,组间比较,差异具有统计学意义(**P0.01),FRRT与Control组相比表达稍减少,组间比较,差异不具有统计学意义(P0.05)。3.2凋亡相关蛋白检测显示,Bax在DOX组中表达较Control组、FRRT组增加,组间比较,差异具有统计学意义(*P0.05),FRRT组较Control组表达稍增加,组间比较,差异不具有统计学意义(P0.05);P53在DOX组中表达较Control组、FRRT组增加,FRRT组与Control组相比表达增加不明显,各组间相比,差异不具有统计学意义(P0.05);Bcl-2在DOX组中表达较Control组、FRRT组减少,组间比较,差异具有统计学意义(**P0.01),FRRT组与Control组比较表达减少,组间比较,差异具有统计学意义(*P0.05)。结论刺梨黄酮通过下调阿霉素引起的心肌细胞自噬和心肌细胞凋亡作用,进而在阿霉素诱导心肌毒性中发挥保护作用。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

免疫荧光检测不同时间原代心肌细胞中LC3-II的表达Fig.1TheexpressionofLC3-IIinprimarymyocardialcellswithimmunofluorescenceatdifferenttimes

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新乡医学院硕士学位论文H9C2 心肌细胞用 5μmol/L 阿霉素孵育，提取不同孵育时间（1h、3h、6h、12h、18h、24h）的蛋白。进行 WB 检测，结果显示为阿霉素孵育细胞 12h 时，自噬相关基因 LC3-II 表达最多，12 小时前 3 个时间组 LC3-II 几乎没有表达，后 2 组较 12 h表达下降。12 h 组与其余 5 组比较，差异具有统计学意义（**P<0.01）（图 2）。

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Western Blotting 检测不同浓度和时间 H9C2 心肌细胞中 LC3-II 的表达（注：组间比较：*P<0.05）ig3 The expression of LC3-II in H9C2 myocardial cells with Western Blotting at differentConcentrations and times. Note：Comparison between groups：*P<0.05）组原代分离培养的心肌细胞形态梯度浓度筛选显示，80μg/mL 刺梨黄酮干预后，对心肌细胞影响明显，显微镜察，阿霉素组细胞生长状态不良，大多细胞缩小且呈现高折光的圆形。空白对细胞生长状态良好，细胞形态多呈现长梭形，心肌细胞规律搏动。刺梨黄酮组，见部细胞缩小呈高折光的圆形状态，大多数仍是长梭形状态（图 4）。

【参考文献】