乌灵菌粉抗抑郁及谷红注射液抗脑缺血再灌注损伤的作用和机制研究

发布时间：2020-07-07 15:44

【摘要】：抑郁症(Depression)又称为抑郁障碍,是一种常见的精神障碍性疾病,其临床表现有心境低落、思维迟缓、意志活动减退、认知功能损害和一些躯体症状,主要包括睡眠障碍、乏力、食欲减退、体重下降等。其发病率呈逐年上升趋势,改善抑郁症的治疗一直是包括精神科在内的众多学科的研究热点。药物治疗是目前治疗抑郁症的主要手段,但抑郁症是一个涉及多种机制的复杂疾病,近年来抗抑郁药物的研制虽有很大进展,但仍缺乏理想的药物。近年来研制的新型抗抑郁药虽然毒性低、不良反应少,但低应答率及长期用药亦可能引起潜在不良反应是面临的主要挑战。因而尚需深入研究其发病机制研究新型治疗药物。乌灵参(Xylariasp)是生长在土栖白蚁巢中的一种真菌的菌核,具有利尿、补心神、治失眠、治疗吐血及产后失血等药用价值。乌灵菌粉是采用深层发酵技术培养乌灵参菌丝体制成的浅棕色至棕色粉末,其胶囊制剂在临床主要用于镇静安神和抗失眠的治疗。乌灵菌粉的抗抑郁、抗焦虑效果在临床上已经得到证实,显示中医药在这方面的独特优势。为了进一步确立这一优势,仍需在作用机制方面进行深入研究。本研究建立了社会竞争失败小鼠抑郁症模型,并通过社交回避反应评价实验观察乌灵菌粉的抗抑郁作用。结果表明模型组小鼠在社交回避反应评价实验中的社交区停留时间比例明显低于对照组动物(P0.01),而乌灵菌粉治疗(低剂量,0.5g/kg、中剂量,1.0g/kg、高剂量,2.0g/kg)后可以显著提高其社交区停留时间比例(P0.05)。同时,模型组小鼠的角落区停留时间比例明显高于对照组动物(P0.01),低、中、高剂量的乌灵菌粉治疗后显著降低了其角落区停留时间比例(P0.05)。随后我们进一步在分子水平上对乌灵菌粉的抗抑郁症作用机制进行探讨。因为近来有不少研究报道社会竞争失败压力会增加啮齿类动物大脑内内质网应激关键蛋白的表达,于是我们采用Western blotting和qRT-PCR对内质网应激相关基因和蛋白的表达水平进行检测。结果发现与对照组相比,模型组小鼠大脑海马内质网应激标志性蛋白GRP78/Bip和PDI的表达水平升高(P0.05),而乌灵菌粉治疗14 d后其表达水平显著降低(P0.05);与正常对照组相比,模型组小鼠海马蛋白IRE1α和基因sXBP1的表达水平显著增加(P0.05),而乌灵菌粉低、中和高剂量治疗14d后其表达水平显著降低(P0.05);此外模型组小鼠海马IRElα的蛋白和sXBP1的基因表达水平明显高于对照组(P0.05),乌灵菌粉治疗后其表达水平明显降低(P0.05);与细胞凋亡相关的基因CHOP转录水平在模型组小鼠海马内显著升高,而Bc12/Bax蛋白表达水平则显著降低(P0.05),而高剂量的乌灵菌粉显著降低其表达水平(P0.05)。上述结果表明,乌灵菌粉能够有效改善社会竞争失败模型小鼠的抑郁症状,具有良好的抗抑郁作用。机制研究显示,乌灵菌粉能够有效维持内质网的内环境稳态进而保护细胞,恢复神经细胞正常功能。脑缺血是目前全球致死率位于第二位的脑血管疾病,缺血再灌注损伤是脑缺血重要的病理生理机制之一。研究证实脑缺血再灌损伤导致了线粒体广泛性的进行性损伤,自噬是清除损伤线粒体的普遍机制,脑内神经元的正常生理活动依赖于线粒体产生的ATP作为能量供体。故线粒体的正常功能在脑缺血的多种损伤与修复阶段起到重要作用。目前临床上脑缺血治疗的方案之一是联合使用溶栓药物与神经保护药物。但如何减少经溶栓处理后的再灌注损伤已经成为一个重要问题。到目前为止,尚缺乏疗效确切且能够对抗脑缺血再灌注损伤的药物。谷红注射液是由乙酰谷酰胺和红花提取液制成的复方制剂,红花提取液含有红花黄色素和红花苷类等有效成分,其中羟基红花黄色素A等对缺血性卒中的保护作用已被众多基础研究所证实。乙酰谷酰胺是谷胺酰胺乙酰基化的衍生物,研究已表明谷氨酰胺可以对抗脑缺血引起的神经元损伤。目前已有大量的临床应用表明谷红注射液对脑缺血患者具有良好的疗效,本实验室的前期研究也显示,谷红注射液可以显著改善实验性脑缺血再灌注损伤大鼠的运动功能。为进一步探讨其具体作用机制,本实验采用大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebralarteryocclusion,MCAO)模型,并通过神经缺损症状评分和贴纸去除实验对谷红注射液的药效学进行评价。结果发现模型组大鼠神经缺损症状评分显著增加(P0.001),双侧前肢完全去除贴纸的时间显著延长(P0.001),经过谷红注射液14 d的治疗后,大鼠神经缺损症状评分显著减少且双侧前肢完全去除贴纸的时间(P0.05)明显缩短。然后对大鼠大脑皮层组织线粒体自噬相关蛋白的表达水平进行检测,结果发现谷红注射液治疗14 d后可有效上调Beclin1、Parkin、KIFC2和UCP3蛋白的表达(P0.05)。综上,本实验观察到谷红注射液对大鼠脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用,而这一作用可能是通过对线粒体功能的保护而实现的。这为谷红注射液的临床应用以及抗脑缺血的新药研发提供了新的理论基础和新思路。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

示意图,社交,评价实验,示意图

后一次应激结束后，将Ｃ５７小鼠单独词养，自由饮食饮水。除正常对卜，将模型小鼠随机分为：模型组（Ｍｏｄｅｌ）、乌灵菌粉低剂量组（Ｗｕｌｉｎｇ，０．５ｇ／ｋｇ）、中剂量组（Ｗｕｌｉｎｇ－Ｍ，邋１．０ｇ／ｋｇ）、高剂量组（Ｗｕｌｉｎｇ－Ｈ，２．ｋｇ）、阳性对照氟西汀组（Ｆｌｕｏｘｅｔｉｎｅ，邋１０邋ｍｇ／ｋｇ）。每组１５只动物。氟于生理盐水，乌灵菌粉溶于０．５％ＣＭＣ－Ｎａ。正常对照组和模型组给予的溶媒，每天定时９点采用灌胃给药方式给药一次，连续给药２邋ｗ。逡逑物行为学检测逡逑用社交回避反应评价进行小鼠行为学检测（图１）。最后一次给药２４邋ｈ行接触－回避反应实验评价小鼠抑郁情况，社交回避反应实验评价的过ｏｏｋＫＪ等人先前描述的相同［１３］。逡逑交回避反应实验的装置包括一个没有顶端的亚克力盒（４２ｘ４２ｘ５０ｃｍ）场，开场内设有两个角落区（ｃｏｒｎｅｒ邋ｚｏｎｅ）邋（９＞＜９邋ｃｍ）和一个相互接触区（ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｚｏｎｅ）邋（２４ｘ１４ｃｍ），交流区内放有一个一端为空的丝网克力长方体（１０ｘ８ｘ５０邋ｃｍ）。逡逑

模型小鼠,海马,菌粉

粉对ＳＤＳ模型小鼠海马内ＧＲＰ７８和ＰＤ丨蛋白表达ｕｌｉｎｇ邋ｐｏｗｄｅｒ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ邋（０．５，邋１．０邋ｏｒ邋２．０邋ｇ／ｋｇ，邋Ｆｌｕｏｘｅ，邋２邋＼ｖ）邋ｏｎ邋ＧＲＰ７８邋ａｎｄ邋ＰＤＩ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓＰ７８邋ｉｎ邋ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ邋ｉｎ邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋ｕｓｉｎｇ邋ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇＩ邋ｉｎ邋ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ邋ｉｎ邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋ｕｓｉｎｇ邋ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔｔｉｎｇｎｓｉｔｙ邋ｗａｓ邋ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ邋ｔｏ邋Ｐ－ａｃｔｉｎ．邋Ａｌｌ邋ｔｈｅ邋ｖａｌｕｅｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｅｇｒｏｕｐ，邋＊Ｐ邋＜邋０．０５邋ｖｅｒｓｕｓ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ；邋ｎＰ邋＜邋０．０５，邋ＵＵＰ邋－ｗａｙ邋ＡＮＯＶＡ邋ｆｏｌｌｏｗｅｄ邋ｂｙ邋Ｌｅａｓｔ邋Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ邋ＳＤＳ模型小鼠海马ＥＲＳ下游通路的影响逡逑邋ｂｌｏｔｔｉｎｇ和ｑＲＴ－ＰＣＲ方法对ＥＲＳ下游通路的具体。结果发现模型组小鼠海马蛋白ＩＲＥｌａ的表达水灵菌粉中剂量（１．０ｇ／ｋｇ）和高剂量（２．０ｇ／ｋｇ）治＜．４４ＢＸＢＰｌ

海马,模型小鼠,基因表达水平,蛋白

表达水平进行检测。结果发现模型组小鼠海马蛋白ＩＲＥｌａ的表达水平也显著增加逡逑（Ｐ＜０．０５），而乌灵菌粉中剂量（１．０ｇ／ｋｇ）和高剂量（２．０ｇ／ｋｇ）治疗１４ｄ后其表逡逑达水平显著降低（尸＜０．０５）（图４Ａ）；如图４Ｂ所示，海马内ｓＸＢＰｌｍＲＮＡ的表达逡逑水平明显高于对照组（Ｐ＜0．0５），乌灵菌粉治疗后其表达水平明显降低（／＞＜０．０５）。逡逑此外，模型组小鼠海马内的Ｐ－ｅＩＦ２ａ的蛋白表达呈上调趋势，而乌灵菌粉治疗后呈逡逑下调趋势（图５Ａ）；而从ｑＲＴ－ＰＣＲ的结果可以发现模型组小鼠海马内的ＡＴＦ４基逡逑因表达水平显著上升（Ｐ＜0．0５）

【参考文献】