基于栅藻和小鼠超微弱发光检测的中药药性初步研究

发布时间：2020-07-07 23:00

【摘要】：中药药性理论是中医药基础理论的核心之一,狭义的中药药性是指寒、热、温、凉四性,在现代中药药性研究中的思路与方法虽然能在一定程度上区分中药的四性,但是大多数利用现代科学探索中药四性理论的研究都脱离了中医基础理论的整体观念。生命体的超微弱发光是机体代谢水平的体现,具有整体性。本实验室前期基于栅藻超微弱发光对中药药性的定量化进行了探索,为了进一步研究,在前期研究的基础上,基于栅藻超微弱发光检测的研究方法对中药的寒热药性进行测定,并检测更具整体性的中药灌胃小鼠的自发发光强度,建立基于小鼠超微弱发光检测研究中药寒热药性的实验平台,在不同的角度对中药药性的定量化进行探讨,比较两种实验方法的优劣,探索中药药性定量化的可行性。研究目的:基于栅藻超微弱发光检测测定中药的寒热药性,探讨该方法的准确性与重复性;检测中药灌胃小鼠的超微弱发光强度,探索能够表征中药寒热药性的参数,建立基于小鼠超微弱发光检测研究中药寒热药性的实验平台,并将小鼠超微弱发光检测的参数与其肝脏生化指标进行相关分析,验证小鼠超微弱发光检测的实验结果;尝试寻找基于栅藻超微弱发光检测研究中的部分中药寒热药性未鉴别成功的原因,比较基于栅藻超微弱发光检测研究中药药性的方法和基于小鼠超微弱发光研究中药药性的方法优劣,探索中药药性客观定量化指标。研究内容:1.基于栅藻超微弱发光的中药寒热药性测定。选取本实验室前期通过栅藻生物指示剂法测定的220味中药中当归、附子、姜黄、紫苏梗、仙茅、黄芩、忍冬藤、生栀子、青蒿、地肤子、高良姜、肉苁蓉、威灵仙、龙眼肉、延胡索、草乌、月季花、地枫皮、灯盏花、千年健、知母、天门冬、板蓝根、车前子、葶苈子、漏芦、茜草、木通、侧柏叶、龙胆草,将这30味中药重复测定,探讨基于栅藻超微弱发光定量化表述中药寒热药性的稳定性、重复性以及前期测定结果的可信度。2.基于小鼠超微弱发光检测中药寒热药性的初步研究。首先探索了相关实验条件,包括小鼠的周龄、体重、被毛、检测部位、灌胃浓度、剂量及时间、麻醉剂量、暗适应时间、仪器检测相关参数设置、数据结果处理分析等。然后在基于栅藻超微弱发光重复测定30味中药药性的结果之下,对小鼠灌胃并检测其自发发光,研究不同药性中药的煎煮液灌胃后小鼠的生物发光指标是否存在规律与差异,并与栅藻超微弱发光重复测定的结果进行比较分析。3.灌胃小鼠肝脏相关生化指标测定。生化指标与机体的代谢水平相关,而生命体的超微弱发光也与机体的代谢相关,所以利用灌胃小鼠肝脏的相关生化指标,验证小鼠超微弱发光检测中药药性的实验可信度。将超微弱发光检测完毕的灌胃小鼠处死,取肝脏,测定其肝脏中超氧化物歧化酶活性(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、钠-钾ATP酶活性(Na~+-K~+-ATPase)、钙-镁ATP酶活性(Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATPase),比较四个生化指标测得的结果,并与灌胃小鼠生物发光的参数进行Pearson相关性分析。本文研究结果:1.通过栅藻生物指示剂法测定中药的寒热药性,10味药性已鉴别成功的中药(当归、附子、姜黄、紫苏梗、仙茅、黄芩、忍冬藤、生栀子、青蒿、地肤子),重复测定的结果与本实验室前期测量结果保持一致。20味药性未鉴别成功的中药(高良姜、肉苁蓉、威灵仙、龙眼肉、延胡索、草乌、月季花、地枫皮、灯盏花、千年健、知母、天门冬、板蓝根、车前子、葶苈子、漏芦、茜草、木通、侧柏叶、龙胆草),其中5味热性药(高良姜、肉苁蓉、威灵仙、龙眼肉、延胡索)、6味寒性药(知母、天门冬、板蓝根、车前子、葶苈子、漏芦、木通)重复测定结果与本实验室前期测量结果保持一致,仍然未能成功鉴别其中药药性;其他9味药的重复测定结果或与前期测定结果不同(与药性相符的,认为鉴别成功),或存在波动等情况,故在后续小鼠实验中舍去,同时考虑木通存在较强的肝肾毒性,亦舍去。此结果说明基于栅藻超微弱发光检测中药的寒热药性具有一定的稳定性和重复性。2.确定小鼠超微弱发光检测研究中药药性的实验中KM小鼠的体重、周龄、是否被毛、灌胃药物浓度与剂量,麻醉剂使用浓度与剂量,暗适应时间、测量时间等一系列基本条件,并在此基础上确定灌胃小鼠最佳灌胃时间及检测时间为第6-10天,同时通过数据整理与分析发现灌胃组小鼠与空白组小鼠超微弱发光检测所得的腹部与背部自发发光强度的比值存在统计学差异。使用10味药性已鉴别成功的中药(5味热性药、5味寒性药)和10味药性未鉴别成功的中药(5味热性药、5味寒性药)灌胃小鼠一定时间后进行检测,发现无论药性是否能够通过栅藻超微弱发光检测鉴别成功,热性药组灌胃小鼠的腹背比值均高于空白对照组,寒性药组均低于空白对照组,均存在统计学差异。3.通过对小鼠肝脏生化指标的测量,发现4组生化指标中,基本存在热性药组高于寒性药组的趋势。在相关性分析中,除少数药组(如T-AOC中高良姜、延胡索,SOD中附子、龙眼肉、知母、车前子,Na~+-K~+-ATP酶活性中紫苏梗、栀子,Ca~(2+)-Mg~(2+)-ATP酶活性中黄芩)的生化指标与其腹背自发发光强度比值之间无线性相关,其余各药组生化指标与灌胃小鼠腹背SE强度比值之间存在显著的相关性。说明中药灌胃引起小鼠机体代谢水平的变化,综合表现为超微弱光子辐射的变化,佐证了基于小鼠超微弱发光检测中药药性的实验具有一定可信度。结论:灌胃小鼠超微弱发光检测实验结果均与药典所载中药药性相符,与生化指标所示的结果基本相一致,且具有相关性。这两种方法存在一定的同步性,都具有整体性,与小鼠的代谢水平有关,且其结果都与药典所载录药性相同,并且超微弱发光检测的方法存在无创与操作简便的优势。辨正的来看,灌胃小鼠超微弱发光检测,跟生化指标的方法一样都只能粗略的区分中药的寒热药性,而无法作为精细区分寒热程度的方法应用。相较之下,栅藻生物指示剂法检测中药药性的操作更简便,成本更低廉,结果更稳定,重复性更好、区分度更高,但目前仍然存在对少部分中药的寒热药性难以鉴别的情况,这可能与中药材的产地、批次、采收季节、炮制方式等有关,还需继续大量的重复和深入的研究。
【学位授予单位】：济南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

栅藻,显微镜,延迟发光,生物指示剂

是一种淡水单细胞绿藻（图 2.1），对其所在的水体环境十分敏感，可分多种水质污染，常用作水质评价的指示生物[45]。栅藻作为生物指示剂、灵敏度高、耗时较短，可以作为基础生物指示剂进行大批量的检测，发光检测的方法可以反映被测样品的整体信息，符合整体观念。实验室的前期实验中，基于栅藻超微弱发光的方法检测了 220 味药性不[70]，通过对激发延迟发光结果的非线性拟合计算出 A、B、C 三个参数算得出 7 次激发延迟发光的 IW值，最后将所得的 7 次激发延迟发光平对时间 t 进行线性拟合得到线性方程斜率 K 值[48]，发现斜率 K 值能够测性。但限于前期实验中的种种因素，对于少部分中药的药性未能成功鉴方法进行中药药性 K 值的重复验证，探讨该法测定中药药性的准确性

背景噪声,仪器,生物光子

2.3 实验结果及分析2.3.1 仪器背景噪声与系统稳定性实验室室温恒定至 20℃，YPMS-2 生物光子测量仪的制冷系统的温度降至-21℃时每天的实验进行之前我们首先检测系统的背景噪声，当背景噪声均值稳定至 10 左，我们认为系统稳定。如图 2.2 所示，以十天的仪器背景噪声为例，可见，系统的背景噪声基本稳定在 10±1。

柱状图,独立样本,平行样,当归

图 2.3 当归平行样本与独立样本三次测定结果柱状图（#p>0.05）2.3 Results of three measurement of the Angelica parallel sample and the independent sam(#p>0.05)平行样本与独立样本三次测定结果如表 2.2 中所示，当归独立样本组三为 9.083、10.624、9.5479，当归平行样本组三次测定结果分别为 8.381、8图 2.3 中我们可以更加直观的看出，独立样本组与平行样本组三次测量两组间无统计学差异（p>0.05）。综合以上实验结果，两种实验方法所得因本部分实验为验证栅藻指示剂法中药药性 K 值的稳定性、重复性与前度，故采用影响因素较多的独立样本来进行实验，使实验结果更具有说鉴别成功的 10 味寒、热性中药药性K值重复测定期测量已鉴别成功的中药中，热性药从 K 值高向低选取 5 味，分别为当归、姜黄 8.57、紫苏梗 7.37、仙茅 7.05，寒性药从 K 值低向高选 5 味，分

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