肉桂醛与肿瘤靶向性化合物ZT-6、8、9设计合成抗肺癌及机制研究

发布时间：2020-07-07 21:09

【摘要】：随着人口的老龄化和环境的破坏,癌症已经成为了危害人类健康影响人类寿命的一种主要疾病之一。随着环境恶化及工作压力增加,癌症的发病率和死亡率呈现逐年递增的趋势。据国家中央癌症登记中心的数据结果表明,2015年预计有429.2万新发癌症病例,其中281.4万癌症患者死亡,肺癌的死亡率高居榜首。目前,化学药物治疗仍是治疗肺癌的主要手段之一,但其毒副作用大、肿瘤耐药性的缺点,使得患者3年生存率大大降低,生活和生存质量下降。针对这一个现状,寻找一种抗肿瘤效果好、毒副作用低的天然化合物,设计合成具有肿瘤靶向性的化合物更成为国内外研究的热点。中医药为我国的宝库,在与疾病做斗争的过程中,基于人体治疗和预防疾病的临床有效验方成为新药筛选研发的宝贵线索。本课题在前期文献检索、专利查询等发现肉桂的挥发油具有抗肿瘤作用,而肉桂醛是其中含量较高的单体化合物之一,通过分析其官能团-“醛”结构,根据醛的理化性质分析其具有抗氧化和氧化的“双重”作用,基于其构-效关系,本课题拟对其抗肺癌作用及其机制进行系统的研究。同时,ZT系列化合物是本课题组设计合成的一类以氨基酸为靶向载体的新型靶向性抗肿瘤药物,其中分别以谷氨酰胺、谷氨酸、精氨酸为癌组织靶向性分布载体,设计合成了ZT-3、ZT-18、ZT-21化合物,经过接种人肺癌荷瘤动物验证其均有不同肿瘤选择性的抗肿瘤作用。本课题也将利用肿瘤组织对不同氨基酸的选择性吸收和分布,对同样具有在肺癌组织中具有靶向性分布的天冬氨酸、瓜氨酸、天冬酰胺进行结构修饰,设计合成ZT-6、ZT-8、ZT-9化合物。本论文主要分为三章:第一章对肉桂醛中药单体体外抗肺癌药效学进行研究,第二章系统地阐述肉桂醛对肺癌的分子靶标及其潜在的作用机制;第三章拟用天冬氨酸、天冬酰胺、瓜氨酸为靶向载体,与草酰氯单乙酯进行缩合藕连成三羧酸循环中关键代谢物质草酰乙酸的类似物ZT-6、8、9,通过改进合成工艺,摸索最佳反应条件,提高纯度至95%以上,获得不易吸潮的固体粉末,为成药性评价奠定基础。第一章肉桂醛体外抗肺癌药效学实验研究采用MTT法检测肉桂醛对非小细胞肺癌SPC-A1细胞的增殖影响。实验结果显示,不同浓度的肉桂醛(0、25、50、100、200μM·L-1)对肺癌SPC-A1处理后,其增殖情况都受到不同程度的抑制作用,其影响呈现浓度和时间依赖性。通过SPSS VII数据统计,体外给予肉桂醛24、48、72hrs后,其抗SPC-A1增殖的半数抑制浓度IC50分别为135.7、41.70和31.71μM·L-1。说明肉桂醛在体外抑制非小细胞肺癌SPC-A1细胞的增殖呈现出较好的时间依赖性。第二章肉桂醛体外抗肺癌机制研究第一节肉桂醛诱导肺癌细胞凋亡实验(1)采用Hoechst 33258荧光染色观察肉桂醛对非小细胞肺癌SPC-A1细胞的形态学变化。实验结果显示,不同浓度的肉桂醛(0、25、50、100、200μM·L-1)对肺癌SPC-A1细胞处理后,置荧光显微镜下观察可见肺癌细胞数量减少,细胞核固缩,浓染而呈亮蓝色,出现凋亡小体,其数量与肉桂醛作用浓度正相关。说明肉桂醛能引起肺癌SPC-A1细胞发生形态学的变化,诱导细胞凋亡。(2)采用流式细胞术结合FITC-AnnexinV/PI双标记染色法检测肉桂醛对非小细胞肺癌SPC-A1细胞的凋亡情况。实验结果显示,不同浓度的肉桂醛(0、25、50、100、200μM·L-1)作用SPC-A1细胞24 h后的总凋亡率分别0.93%,11.5%,26.9%,46.3%,64.4%,呈浓度依赖性。并且,数值与MTT法检测所得的抑制率基本一致,说明肉桂醛影响SPC-A1细胞的增殖与诱导细胞发生凋亡有关。第二节肉桂醛对肺癌细胞周期的影响采用流式细胞术检测肉桂醛对非小细胞肺癌SPC-A1细胞的周期影响。通过PI染色,观察到对照组是典型的肿瘤细胞增殖周期的峰形,而在肉桂醛作用SPC-A1细胞12 h后,细胞周期的各个时期均发生了显著的变化,随着肉桂醛浓度的升高,细胞S期比例随着肉桂醛浓度升高,表现出一定的浓度依赖性,但G0/G1期与G2/M期没有表现出一定的量效关系。该实验结果提示,肉桂醛有可能通过阻滞SPC-A1细胞周期的S期,影响有丝分裂的进行从而诱导细胞凋亡。第三节肉桂醛对肺癌细胞线粒体膜电位的影响采用流式细胞术通过JC-1荧光探针检测肉桂醛对非小细胞肺癌SPC-A1的线粒体膜电位(MMP)的影响。在肉桂醛处理SPC-A1 12 h后,不同浓度的实验组相对于对照组均表现出了线粒体膜电位的下降现象,且随着肉桂醛浓度的不断增加,膜电位下降的细胞比例变大,呈现浓度依赖性。MMP下降说明肉桂醛诱导的凋亡属于线粒体介导的凋亡途径。第四节肉桂醛对细胞活性氧的影响采用流式细胞术通过DCFH-DA荧光探针检测肉桂醛对非小细胞肺癌SPC-A1胞内活性氧水平的影响。结果显示,与对照组进行对比不同浓度的肉桂醛处理SPC-A1细胞12 h后,低浓度的肉桂醛即能提高活性氧ROS的水平,但高浓度的肉桂醛升高活性氧的水平更加显著,呈现出很明显的浓度依赖性。说明肉桂醛有可能通过扰乱细胞内的氧化还原平衡,尤其是提高ROS水平来诱导肿瘤细胞凋亡。第五节肉桂醛对非小细胞肺癌细胞Bax和Bcl-2凋亡相关蛋白表达的影响。利用Western Blot检测分析Bax和Bcl-2凋亡相关蛋白表达,实验结果显示,不同浓度的肉桂醛孵育SPC-A1细胞24 h后,促凋亡蛋白Bax随着肉桂醛的浓度,表达量也随之增加,而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量则呈现下降趋势,肉桂醛诱导恶性肿瘤细胞的凋亡指数Bax/Bcl-2呈现出剂量依赖性。第六节肉桂醛对Trx抗氧化系统Trx和TrxR蛋白表达的影响利用Western Blot检测肉桂醛介导非小细胞肺癌SPC-A1细胞Trx抗氧化系统Trx和TrxR蛋白表达水平。肉桂醛作用于SPC-A1细胞后,胞内的硫氧还蛋白Trx和硫氧还蛋白还原酶TrxR的表达水平呈现剂量依赖性上升,该结果证明了肉桂醛能激活Trx系统,从而导致胞内活性氧的积累,启动凋亡程序。第三章基于肿瘤靶向性分布的氨基酸为载体的药物ZT-6、8、9的设计合成基于氨基酸为肿瘤组织靶向性分布的载体,分别以天冬氨酸二叔丁基盐酸盐、瓜氨酸叔丁基盐酸盐、天冬酰胺叔丁基盐酸盐与草酰氯单乙酯为原料,采用液相合成法,发生酰化耦合,酸性环境下脱去叔丁基保护基团,设计合成具有肿瘤靶向性的化合物ZT-6、8、9。经高效液相色谱、氢谱、碳谱和质谱等技术确认其分子量及化学结构,检测结果发现与原设计目标化合物相吻合。综上所述,本研究的结果显示,肉桂醛可以抑制肺癌细胞SPC-A-1的增值,而且其抗癌作用与通过线粒体介导的凋亡途径,通过阻滞细胞周期的S期影响肿瘤细胞的有丝分裂,激活抗氧化系统Trx系统引起胞内活性氧ROS水平的积累,随后激活促凋亡基因Bax和抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达,发挥综合作用诱导细胞凋亡。本研究系统地研究了肉桂醛的抗癌作用,并阐明了其部分作用机制,为进一步评估肉桂醛的成药性开发新药奠定了基础。另外,本研究设计了并成功合成了新化合物ZT-6、8、9,其纯度均达到96%以上,通过改善纯化工艺,获得了纯度高于97%的白色固体粉末。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;R285
【图文】：

精氨酸,家族,瓜氨酸,琥珀酸

胖、糖尿病、代谢性疾病等提供了可行的治疗方法。，瓜氨酸在一定作用下释放出NO，体内NO是在一氧化氮合酶由精氨酸分解生成的，瓜氨酸是该反应的副产物。瓜氨酸通过精氨酸琥珀酸合成成酶(AS)及精氨酸代琥珀酸裂解酶(AL)重即瓜氨酸-NO循环[70]。张一文等[71]发现培养液中加入精氨酸,可瓜氨酸代替精氨酸，亦可出现NO的合成。胺是人体必需氨基酸，是蛋白质组成之一，在体内，天冬酰胺化下分谢成天冬氨酸及氨基。在机体缺氧时，天冬酰胺能转换成草酰乙酸，参与三羧酸循环，产生大量的能量。另外，天冬前体物质，是在谷草转氨酶、二氢吡咯-5-羧酸合成酶（P5CS共同作用下完成的。鸟氨酸是鸟氨酸循环中重要的组成部分，转移酶生成瓜氨酸，进而在精氨酸代琥珀酸合成酶生成精氨NOS 催化生成 NO[72]。

酶促反应

图 2 Trx 系统的酶促反应[92]Fig.2 Enzymatic reactions of the thioredoxin system[92]细胞内 Trx 系统作为氧化还原调节剂，通过消除 ROS 来保护细胞免受过高的 ROS 引起的氧化应激反应，维持细胞内氧化还原动态平衡。TRX 系统在许多生理过程，作为细胞抗氧化剂发挥着重要的作用[93]。相比正常细胞，癌细胞存在线粒体结构上的差异与缺陷，通常需要消耗更多的能量来维持不受限的增殖及逃避细胞凋亡，导致胞内的活性氧水平升高，胞内抗氧化蛋白也表达上调。相比正常细胞，在许多原发肿瘤中，TRX 系统蛋白过表达，促进恶性细胞的增殖[94]。在细胞质和线粒体中，存在着丰富的 Trx 系统只要抑制任何一个系统都能激活细胞凋亡信号通路。目前，已经有一部分 Trx 或者 TrxR 抑制剂被列为肿瘤化疗候选药物用来诱导细胞凋亡。辛二酰苯异羟肟酸（SAHA）通过上调 Trx 系统的内源性抑制剂来抑制肿瘤细胞的增殖。其他靶向

肉桂醛,生长抑制

图 4 肉桂醛对 SPC-A1 细胞生长抑制的影响Fig.4 Cinnamaldehyde inhibit growth of SPC-A1 cell in vitro. Cell proliferation wassessed with MTT assay. Columns represent mean values while error bars representSEM(n=3)(*P<0.05,**p<0.01 vs Control group)4 实验讨论MTT 法是一种较为常见检测细胞存活和增殖的实验方法。活细胞线粒的琥珀酸脱氢酶能外源性的 MTT 还原生成不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Form二甲基亚砜（DMSO）是一种“万能溶剂”，能溶解细胞中的甲瓒，用酶联检测仪在 570 nm 波长处测定光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT 结晶形数量与细胞数成正比，可间接反映活细胞数量。该方法已经广泛应用于大规肿瘤药物的筛选，此方法具有灵敏性高和经济等优点。本章实验是采用 MTT 法来检测肉桂醛对人肺癌 SPC-A1 细胞增殖的影

【参考文献】