PM2.5对血管内皮细胞的影响及白藜芦醇干预研究
发布时间：2020-07-07 19:09
【摘要】：研究背景及目的:大气污染是影响公众健康的首要环境危险因素,我国已经成为世界上大气污染最严重的国家之一,研究大气污染的危害性和防治方法成为社会和健康的迫切需要。大气PM2.5(particulate matter,2.5)是指空气动力学直径等于或小于2.5微米的颗粒物,既可以通过引起肺部炎症进而造成全身炎症性反应,也可以进入血液循环进而直接影响全身多个器官,与包括慢性阻塞性肺疾病、动脉粥样硬化(aterosclerosis,AS)和代谢综合征在内的多种疾病的发生发展密切相关。AS的发生发展与PM2.5对血管内皮功能损伤、脂质浸润、慢性炎症等有关。PM2.5作用于人体,其所含有的水溶性成分、酸溶性成分会刺激人体释放一系列的炎症因子诱发炎症反应,导致AS斑块的进展;同时氧自由基的表达增多,使细胞处于氧化应激状态,功能下降,可引发细胞凋亡以及多种心血管疾病的发生。白藜芦醇(resveratrol,RES)是从中药虎杖中提取的一种多酚类物质,具有广泛的药理作用,尤其在抗氧化、抗炎及治疗心血管系统疾病方面作用明显。本实验从白藜芦醇对PM2.5诱导的EA.hy926细胞凋亡和炎症因子表达的影响展开研究,探讨白藜芦醇的保护作用及其机制,为白藜芦醇用于治疗和预防PM2.5导致的心血管疾病及其相关并发症提供实验依据。方法:1.白藜芦醇对血管内皮细胞活性的保护效果:培养血管内皮细胞EA.hy926,给予PM2.5加或不加白藜芦醇处理,采用CCK-8法检测白藜芦醇预处理对PM2.5诱导的EA.hy926细胞活性的影响。2.白藜芦醇对PM2.5诱导的血管内皮细胞氧化应激和凋亡的保护作用:取血管内皮细胞EA.hy926,分为阴性对照组、PM2.5组(PM2.5终浓度为100 u g · mL-1)、PM2.5+NAC 组(PM2.5 终浓度为 100 μ g · mL-1 NAC 终浓度为 10 μ mol · L-1)、PM2.5+RES组(PM2.5终浓度为100μg·mL-1,RES终浓度分别为5、10、20μmol · L-1)。通过H2DCF-DA荧光探针法,观察各组细胞胞内R0S含量的变化:采用Annexin V-FITC/PI双标法标记细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡情况;采用Western blot法检测亡相关蛋白(Cytochrome C、Caspasc 3、Caspase 9、PARP)表达及活化的情况。3.PM2.5对IL-8表达的影响及白藜芦醇干预研究;(1)首先设置分组为阴性对照组、PM2.5 组(终浓度为 100 u g · mL-1)、SB203580+PM2.5 组(PM2.5 终浓度为 100μ g · mL-1,SB203580 终浓度为 25 μ mol · L-1)、SP600125+PM2.5 组(PM2.5 终浓度为100 μ g · mL-1,SP600125终浓度为25 μ mol · L 1),用qRT-PCR法检测各组细胞因子IL-8 mRNA表达情况,分析PM2.5对IL-8表达的影响及其信号通路;(2)白藜芦醇干预作用:实验分为阴性对照组、PM2.5组、PM2.5+不同浓度RES组,刺激24h后用qRT-PCR法检测EA.hy926细胞IL-8 mRNA的表达情况;(3)白藜芦醇作用的相关信号通路:用 Western blot 检测 p38 MAPK 及 Phospho-p38 MAPK 蛋白的表达变化。结果:1.与阴性对照组比较,5、10、20 μ mol·L-1 RES组细胞活性无明显统计学意义(p0.05);当浓度为50、100、200 μ g · mL-1 PM2.5组时可以抑制细胞活性(p0.05,p0.01),我们选择100μg·mL-1作为后续试验的有效干预浓度;用不同浓度白藜芦醇预处理2h后细胞活性明显增高,与PM2.5(100 μ g · mL-1)组比较具有统计学意义(P0.05,0.01)。2.与阴性对照组比较,PM2.5(100μg·mL-1)可诱导细胞内ROS生成增多、细胞凋亡(p0.01),并使凋亡相关蛋白 Cytochrome C、Caspase 3、Caspase 9、PARP 表达增高或活化;与PM2.5(100μ g · mL-1)组比较,白藜芦醇及NAC预处理能显著抑制PM2.5诱导的ROS生成及细胞凋亡,同时可见Cytochrome C表达下调和Caspase 3、Caspase 9、PARP 活化减少。3.与阴性对照组比较,PM2.5(100μg·mL-1)组IL-8 mRNA表达明显升高(p0.01);与PM2.5组比较,加入p38 MAPK信号通路抑制剂SB20380后IL-8 mRNA的表达下降并具有统计学意义,加入JNK信号通路抑制剂SP600125对IL-8 mRNA表达无明显影响;不同浓度的白藜芦醇预处理可显著下调IL-8 mRNA的表达(p0.05,p0.01);Western blot结果显示,在PM2.5刺激后Phospho-p38蛋白显著上升(p0.01);而用10,20μmol·L-1白藜芦醇预处理可显著下调Phospho-p38蛋白的表达(p0.01)。结论:1.PM2.5能对EA.hy926细胞有明显毒性;白藜芦醇预处理可显著抑制PM2.5对EA.hy926细胞的毒性,发挥保护作用。2.PM2.5可导致EA.hy926细胞氧自由基生成增多,凋亡细胞比例及凋亡蛋白表达升高;而白藜芦醇预处理可显著降低PM2.5诱导的EA.hy926细胞凋亡,这一保护作用可能是通过减少细胞内ROS的生成发挥作用的。3.PM2.5可通过激活p38 MAPK信号通路诱导EA.hy926细胞IL-8 mRNA的表达;白藜芦醇预处理可显著降低PM2.5引起的EA.hy926细胞IL-8 mRNA的表达,这可能是通过干预p38 MAPK信号通路发挥作用的。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：
２．邋３．邋５结果逡逑２．邋３．邋５．邋１邋ＰＭ２．邋５影响ＥＡ．邋ｈｙ９２６细胞ＩＬ－８邋ｒａＲＮＡ表达的信号通路逡逑图１１结果显示，ＰＭ２．邋５刺激后细胞炎性因子ＩＬ－８邋ｍＲＮＡ表达水平明显升高，与阴逡逑性对照组比较差异具有统计学意义（／？〈0．邋０１）；与ＰＭ２．邋５组比较，ＳＢ２０３５８０组（ＳＢ）邋ＩＬ－８逡逑的ｍＲＮＡ表达呈现下降趋势，并且具有统计学意义（；？＜０．邋０５）邋；邋ＳＰ６００１２组（ＳＰ）ＩＬ－８逡逑的ｍＲＮＡ表达呈现与预期相反的趋势，没有统计学意义＞０．０５）。这表明，ＰＭ２．邋５逡逑可能通过ｐ３８邋ＭＡＰＫ信号通路导致炎性因子ＩＬ－８邋ｍＲＮＡ表达水平上升。逡逑１０－１逡逑８－逦＆＆逦ｎ￣ｍｌｉ邋ｒｍ逡逑６邋Ｍ逡逑°？逡逑 ２－邋＝＝■■逡逑Ｊｌ逦，邋Ｉ逦，逦１１１１１１１１１１１逡逑Ｏ逦ｐｍ２．５逦ＳＢ逦ＳＰ逡逑浓度均为２邋５ｐｉｒｉｏ卜Ｌ／１逡逑ＰＭ２．５（邋Ｉ邋００邋Ｍｇ＇邋ｎｉＬ＇１）逡逑注：与对照组比较，＜０．０５；与ＰＭ２．邋５组比较，＞＜０．０５。逡逑图１１白藜芦醇对ＰＭ２．邋５导致的ＥＡ．邋ｈｙ９２６细胞丨Ｌ－８邋ｍＲＮＡ表达信号通路的影响逡逑（ｎ＝３）逡逑Ｆｉｇ．１１邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏＩ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐａｔｈ邋ｏｆ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＩＬ￣８邋ｍＲＮＡ逡逑ｉｎ邋ＰＭ２．５￣ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＥＡ．邋ｈｙ９２６邋ｃｅｌｌｓ逡逑２．邋３．邋５．邋２白藜芦醇对ＰＭ２．邋５导致的ＥＡ．邋ｈｙ９２６细胞炎性因子ＩＬ－８表达的影响逡逑结果如图１２所示
ｉｎ邋ＰＭ２．５￣ｉｎｄｕｃｅｄ邋ＥＡ．邋ｈｙ９２６邋ｃｅｌｌｓ逡逑２．邋３．邋５．邋２白藜芦醇对ＰＭ２．邋５导致的ＥＡ．邋ｈｙ９２６细胞炎性因子ＩＬ－８表达的影响逡逑结果如图１２所示，ＰＭ２．邋５刺激后细胞炎性因子比－８邋ｍＲＮＡ表达明显升高，与阴性逡逑对照组比较差异具有统计学意义〈０．０１），而白藜芦醇预处理可以使ＩＬ－８邋ｍＲＮＡ逡逑表达下降，与ＰＭ２．邋５组比较有统计学意义（／ｐ邋＜０．０５，逦＜０．０１）。本实验结果表明，逡逑不同浓度的白藜芦醇预处理可显著下调ＩＬ－８邋ｍＲＮＡ的表达。结合图１１的结果，我们逡逑分析白藜芦醇可以下调ＰＭ２．邋５诱导的ＥＡ．邋ｈｙ９２６细胞ＩＬ－８邋ｍＲＮＡ表达，可能通过干预逡逑ｐ３８邋ＭＡＰＫ信号通路发挥作用，我们将结合以上实验结果进行下…步的实验研究。逡逑２８逡逑
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本文编号：2745499
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：
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本文编号：2745499
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