小檗碱对晚期糖基化终末产物（AGEs）诱导的小鼠小胶质细胞活化的干预作用

发布时间：2020-07-08 07:09

【摘要】：[目的]研究晚期糖基化终末产物对小鼠小胶质细胞的活化及小檗碱对该活化的干预作用。[方法]1、建立小胶质细胞活化模型:将小胶质细胞按3×104/mL的密度接种细胞于96孔板或6孔板内爬片上,普通培养基培养过夜,待细胞贴壁后更换成不同浓度(100μg/mL,200μg/mL,300μg/mL,400μg/mL)的 AGEs 无血清培养基培养 24h,MTT法检测细胞活力,ELISA法检测细胞上清液中TNF-α的分泌情况,细胞免疫荧光染色法观察细胞表面特异性蛋白CD68的表达以确定最佳药物浓度。2、建立小胶质细胞活化模型后,将细胞分为对照组、AGEs组、小檗碱组,培养24h后倒置相差显微镜下观察细胞的形态变化,MTT法检测细胞活力,细胞免疫荧光染色法观察细胞表面特异性蛋白CD68的表达,ELISA法检测细胞上清液中TNF-α的分泌情况,Western blotting检测细胞活化相关蛋白的表达。[结果]1、AGEs及小檗碱对小胶质细胞形态的影响倒置相差显微镜下可见:小胶质细胞约70-80%贴壁生长,胞体呈梭状或三角状,约20-30%悬浮生长;AGEs组小胶质细胞贴壁数量增多,且随着AGEs浓度的不断升高,部分细胞活化为胞体较大、突起缩短的阿米巴样类巨噬细胞。BSA对照组与常规对照组表现类似。小檗碱干预后阿米巴样细胞数目减少,多为梭形或三角状细胞,提示AGEs能在一定程度上改变小鼠小胶质细胞形态,而小檗碱对AGEs导致的形态学改变有一定的恢复作用。2、AGEs及小檗碱对小胶质细胞活力的影响与CON组相比,不同浓度AGEs组及小檗碱组与CON组之间OD值无明显差异(P0.05)。3、AGEs及小檗碱对小胶质细胞表面特异性蛋白CD68荧光信号的影响FITC通道下观察:各组特异性的CD68绿色荧光信号均定位于细胞膜表面,AGEs组与常规对照组相比,绿色荧光均较对照组弱,其中300μg/mL AGEs组细胞表面绿色荧光最弱;小檗碱组绿色荧光虽较对照组偏弱,但较AGEs组有所增强;阴性对照组细胞外几乎见不到绿色荧光。DAPI通道下观察:各组均可见蓝色荧光的细胞核。4、AGEs及小檗碱对小胶质细胞上清液中TNF-α分泌量的影响不同浓度AGEs组细胞上清液中TNF-α分泌量分别为1098、1184、1398、1433(单位pg/mL)较对照组61pg/mL显著升高(P0.001),但各组间TNF-α分泌量无显著性差异(P＞.05)。BSA阴性对照组与CON组相比上清液中TNF-α分泌量无显著性差异(P＞0.05)。与AGEs组相比,小檗碱组细胞上清液中TNF-α分泌量无显著性差异(P＞0.05)。5、AGEs及小檗碱对小胶质细胞活化相关蛋白表达的影响与CON组相比,AGEs组小胶质细胞中CD68、RAGE及p NF-κB p65蛋白的表达量均明显升高(P0.01,P0.05,P0.01)。小檗碱组CD68与pNF-κBp65蛋白的表达量均较AGEs组显著下降(P0.01,P0.05),RAGE蛋白的表达量较AGEs组没有下降(P0.05)。[结论]1、300μg/mLAGEs培养小鼠小胶质细胞24h,在不影响细胞活力的条件下,可显著上调细胞上清液中的炎性细胞因子TNF-α的分泌量,同时可增加CD68、RAGE及p NF-κ Bp65蛋白的表达。2、小檗碱可以显著下调小鼠小胶质细胞CD68和pNF-κBp65蛋白的表达,抑制300μg/mL AGEs培养条件下小胶质细胞的活化,但对RAGE的表达没有影响。[创新点]首次证明AGEs对小鼠小胶质细胞有活化作用及小檗碱对该活化有干预作用。这一研究结果将为阐述小檗碱改善糖尿病认知障碍,发挥脑保护作用的作用机制提供支持,为进一步寻找治疗糖尿病认知障碍的中药提供理论依据。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

科学院北京协和医学院逦硕士研宄生学位验结果逡逑同浓度ＡＧＥｓ对小胶质细胞形态的影响逡逑胞贴壁生长后，按实验分组更换成相应培养基继续培养２４ｈ后倒置相察细胞形态，如图一所示，镜下可见：细胞约７０－８０％贴壁良好，胞角状，约２０—３０％悬浮生长。不同浓度ＡＧＥｓ千预２４ｈ后细胞贴壁数９０％贴壁，且随着ＡＧＥｓ浓度的不断升高，部分细胞活化为胞体较大阿米巴样类巨噬细胞（见图中红色箭头标记处）。另外，４００ｐｇ／ｍＬＡ数凋亡细胞（见图中黑色箭头标记处）。以上结果提示ＡＧＥｓ能在一小鼠小胶质细胞形态，尤以３0｛＾ｇ／ｍＬＡＧＥｓ组和４００ｐｇ／ｍＬＡＧＥｓ组形显，但４００（ａｇ／ｍＬＡＧＥｓ可能对细胞已产生毒性损伤作用。逡逑

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图２邋ｌＯＯｐｇ／ｍＬＡＧＥｓ培养２４ｈ后小胶质细胞形态：胞体大多呈梭状，逡逑贴壁细胞较常规培养组增多；仍可见少数悬浮细胞逡逑＇邋？＇邋－邋．．．邋｜逡逑－－逦．．．邋＊邋ｖ邋－邋－邋＇邋＊＇？逡逑？逦！邋４Ｔ：邋■邋■逦．邋■．逡逑？邋＇邋．逡逑？逡逑２００Ａ逡逑

【参考文献】

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1 张跃其;王培昌;;阿尔茨海默病相关信号转导通路研究进展[J];医学综述;2015年10期

2 李燕;陈素红;吉星;耿争刚;吕圭源;;白术多糖对自发性2型糖尿病小鼠血糖及相关指标的影响[J];中国实验方剂学杂志;2015年10期

3 朱振国;黄艳君;张元涛;李剑敏;;黄连素对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠神经保护作用的实验研究[J];中国临床药理学杂志;2015年01期

4 杨吉平;费琳;张军峰;赵朝华;徐曦;;小檗碱对Aβ_(25~35)诱导的阿尔茨海默病细胞模型的保护作用[J];中国老年学杂志;2014年20期

5 江美玲;许岸高;;2型糖尿患者肠道菌群特征分析[J];广东医学;2013年13期

6 朱振国;黄艳君;李剑敏;;黄连素对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠影响的研究[J];中华中医药学刊;2013年07期

7 韩亮;许明;李艳琴;郭俊杰;冯玛莉;王晓炯;;吡格列酮对KKAy小鼠肠道菌群的影响[J];食品与药品;2013年03期

8 胡江;费建梅;吴林根;;黄连素对2型糖尿病患者肠道菌群影响初探[J];淮海医药;2013年01期

9 杨思思;姜藤;张木勋;;二甲双胍降低肥胖大鼠海马内PPARγ、IDE表达伴随TNF-α和Aβ42表达上调[J];中国生物化学与分子生物学报;2013年01期

10 杜樱洁;冶岱蔚;;千金黄连丸及其拆方治疗2型糖尿病胰岛素抵抗的实验研究[J];新疆中医药;2012年04期

本文编号：2746248