盐肤木三萜成分的提取及其靶向酸性微环境的抗结直肠癌作用机制研究

发布时间：2020-07-08 11:39

【摘要】：目的:本文旨在分离和纯化盐肤木三萜成分(TER)并探讨其通过作用于结直肠癌(CRC)酸性代谢产物以及微环境进而发挥抗结直肠癌作用的机制。方法:将盐肤木根茎的60%乙醇粗提物分别用石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、正丁醇萃取,选择1-20min内出峰最多的部位进一步用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱;MTT法检测各洗脱成分的抗肿瘤效应;MTT法比较正常肠上皮HCoEpiC细胞和结肠癌SW620细胞对TER的敏感性;流式细胞仪检测SW620细胞凋亡情况;同时采用CT26小鼠结肠癌细胞建立小鼠皮下瘤模型,并给予不同浓度的TER处理,以阳性药5-Fu作为对照,测量肿瘤体积并计算抑瘤指数。通过HE染色、免疫组化染色以及Tunnel染色分析小鼠肿瘤组织,观察TER治疗后的肿瘤组织形态变化、核增殖抗原Ki67的表达以及小鼠体内肿瘤组织凋亡的情况。试剂盒测定SW620细胞的葡萄糖摄取率和乳酸生成率;基质胶侵袭试验测定SW620细胞的侵袭能力;Western blot检测SW620细胞的糖酵解关键酶、H~+交换相关蛋白以及酸敏感离子通道(ASIC)家族成员的表达;检测SW620细胞中MMPs蛋白的表达,免疫组化法检测肿瘤组织中MMP-9蛋白的表达;结果:HPLC检测三萜类成分主要存在于二氯甲烷洗脱部位,但杂质较多,主峰不明显,用二氯甲烷-甲醇进一步梯度洗脱后,得到的9号样品1-20 min内出峰分离度较好,主峰明显,含有桦木酸浓度为0.528 mg/mL,桦木酮酸浓度为0.632 mg/mL,将9号样品作为TER进行后续研究。MTT结果显示,TER可以有效抑制HCT116和SW620两种结肠癌细胞的增殖,其抑制HCT116细胞的IC_(50)值为62.27μg/mL,抑制SW620细胞的IC_(50)值为53.31μg/mL。但对正常肠上皮细胞HCoEpiC无显著抑制作用,200μg/mL浓度时的抑制率仅为32%。在体实验结果也表明TER可以有效抑制小鼠肿瘤的生长,HE染色结果显示TER可以使肿瘤组织出现损伤和坏死,免疫组化实验结果表明TER下调肿瘤组织中核增殖抗原Ki67的表达;流式细胞术结果显示100μg/mL浓度的TER显著促进SW620细胞凋亡,P0.01,同时Tunnel染色结果显示经不同浓度TER治疗后的小鼠肿瘤组织中凋亡细胞数目增多。TER可以显著抑制SW620细胞的葡萄糖摄取和乳酸生成(100μg/mL浓度时,P0.001),并下调糖酵解关键蛋白GLUT1、PKM2和LDHA以及H~+交换相关蛋白MCT1和NHE1的表达,同时ASIC2和钙调神经磷酸酶/活化T细胞核因子(NFAT)通路蛋白的表达均被下调。TER处理SW620细胞后,Western blot检测到MMP-2、MMP-9蛋白的表达减少,同时基质胶侵袭试验结果显示SW620细胞的侵袭能力降低;在TER治疗后的小鼠肿瘤组织中观察到MMP-9蛋白的表达被下调。结论:我们的研究结果表明了从盐肤木中提取的TER可以通过靶向CRC酸性微环境并抑制ASIC2诱导的钙调神经磷酸酶/NFAT途径,有效抑制CRC细胞的生长和侵袭,可以作为治疗结直肠癌的辅助疗法。
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285
【图文】：

处理人结肠癌 HCT116 细胞 24 小时，如图 2.2 A 所示，2 号，9 号，11 号，13号，18 号，75 号，82 号和 88 号对 HCT116 细胞增殖呈现较好的抑制效果。接着用这8个组分处理SW620细胞24小时，从图2.2 B可以看出9号样品对SW620细胞的抑制效果明显优于其他几个组分，并且在经过培养基稀释后 9 号能够较好地分散于培养基中，因此我们选择了 9 号组分作为盐肤木总三萜成分（TER）进行后续的研究。如图 2.2 C 所示，用倒置显微镜观察 TER 处理后的 SW620 细胞生长情况，结果发现随着剂量的增加，细胞数量明显减少并且出现明显的形态学变化，细胞逐渐皱缩变圆。A

162.4 本章小结本章研究首先通过乙醇回流方法对盐肤木进行粗提后用乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷萃取，根据标准品的最大吸收波长选择检测波长，并根据其峰形调整流动相确定HPLC色谱条件。采用HPLC测定三萜类成分主要存在于二氯甲烷部位，图 2.3 盐肤木总三萜中的化学成分和含量Fig.2.3 Component and Content of triterpenoids of Rhus chinensis Mill（注：（A）盐肤木总三萜类化合物的 HPLC 图谱。（B）桦木酸，桦木醇，桦木酮酸和半乳酸对照品。）

盐肤木三萜成分分离及其抗结直肠癌作用机制研究R 对结直肠癌的细胞选择性毒性了研究 TER 是否具有肿瘤细胞的选择性毒性，用不同的浓度的 T结肠癌 SW620 细胞与人正常结肠上皮细胞 HCoEpiC 细胞 24 h。所示，在25~200 μg/mL浓度范围内，相同浓度下的TER处理后，细胞活性显著高于 SW620 细胞的活性（P<0.05）,显示出较低的敏mL 的 TER 作用下， HCoEpiC 细胞的存活率为 68 %左右， 而存活率仅为 27 %左右。 此结果说明 TER 具有选择性细胞毒性细胞的靶向性。

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本文编号：2746488