基于结肠AQPs的表达研究当归“润肠通便”传统功效的药理机制

发布时间：2020-07-08 18:14

【摘要】：目的:“润肠通便”是当归主要传统功效之一,历代本草多有记载,中医临床以其配伍治疗血虚便秘疗效确切,但药理机制不明。本研究通过建立血虚便秘小鼠模型,并基于结肠水通道蛋白(AQPs)表达与便秘的关系,从宏观药效和微观分子生物学水平研究探讨当归“润肠通便”传统功效的药理机制,诠释其传统功效理论的科学内涵。方法:1.中药治疗便秘文献可视化研究以“中药”、“中草药”、“中成药”、“草药提取物”、“便秘”为检索词检索相关期刊论文(1994.1-2016.7)、维普中文科技期刊全文数据库(1989.1-2016.7)、万方数字化期刊全文数据库(1997.1-2016.7)和中国生物医学文献数据库(1978.1-2016.7),采用BICOMS、g CLUTO和Ucinet软件对中药治疗便秘的研究文献进行社会网络可视化分析,以期较全面掌握中药治疗便秘的研究现状,为本课题的顺利实施提供理论参考。2.血虚便秘小鼠模型的建立与评价(1)皮下注射乙酰苯肼(APH)联合腹腔注射环磷酰胺(CPA)、灌胃复方地芬诺酯(DPN)、皮下注射APH联合腹腔注射CPA并灌胃DPN三种方法分别建立血虚、便秘及血虚便秘小鼠模型,以中医血虚便秘证候为主要判断标准,结合小鼠外周血液学指标(RBC、WBC、HGB和HCT)和排便情况,对三种小鼠模型进行评价,同时用当归对三种模型进行干预和反证。(2)分析血虚便秘模型小鼠粪便性状、结肠含水量、结肠组织形态及黏液分泌功能、结肠AQPs的表达等宏观和微观指标的差异化表达,为研究和分析当归“润肠通便”的药理机制建立模型准备。3.当归对血虚便秘模型小鼠宏观药效指标的影响96只小鼠按性别、体重随机分为正常组、血虚便秘组、阳性组和当归高、中、低剂量组,除正常组外,其余各组以APH+CPA+DPN联合复制血虚便秘模型,并以不同剂量当归水煎液予以干预。观察各组小鼠一般状况、粪便性状、外周血液学指标(RBC、WBC、HGB和HCT)、排便时间、粪便和结肠含水量,取结肠组织进行HE和AB-PAS染色,观察结肠组织形态和黏液分泌情况。4.当归对血虚便秘模型小鼠结肠AQPs表达及调控机制的影响建立血虚便秘小鼠模型并以当归进行干预,取小鼠结肠组织,采用免疫组织化学技术(IHC)检测结肠AQP4和AQP8的表达;实时荧光定量聚合酶链反应技术(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹技术(WB)分别检测结肠AQP4m RNA、AQP8 m RNA和AQP4、AQP8的表达;酶联免疫技术(ELISA)检测结肠磷脂酶C(PLC)、三磷酸肌醇(IP3)、钙调素(Ca M)、腺苷酸环化酶(AC)、环磷酸腺苷(c AMP)和蛋白激酶A(PKA)水平。5.当归“润肠通便”功效药效物质基础的初步探讨建立血虚便秘小鼠模型,以当归水煎液、当归多糖和当归挥发油进行干预,观察各组小鼠血虚便秘证候、粪便性状、外周血RBC、WBC、HGB和HCT、排便时间、粪便和结肠含水量等指标,对当归“润肠通便”功效的药效物质基础进行初步探讨。结果:1.目前中药治疗便秘的研究领域主要有:“中药治疗慢传输性便秘的基础与临床研究”、“中西医结合治疗慢性功能性便秘和老年功能便秘的临床症状及疗效研究”、“中药制剂治疗习惯性和老年性便秘的临床疗效观察”、“泻下中药治疗腹胀便秘”及“顽固性便秘和肠燥便秘的临床治疗情况研究”等。研究文献涉及的治疗便秘的中药共有1044种,以当归出现频次最高(1446),其次为大黄(945)、枳实(943)、肉苁蓉(880)、黄芪(846)等。对出现频次大于49的95种中药进行社会网络分析,当归处于网络的中心位置,而大黄、肉苁蓉、厚朴、枳实、火麻仁、白术和黄芪处于当归周围。2.APH联合CPA造模、DPN单因素造模均不能建立符合中医血虚便秘证候的小鼠模型;APH+CPA+DPN三因素复合建立的血虚便秘模型小鼠出现蜷缩萎靡、体毛枯疏、光泽暗淡,耳、鼻、唇、尾苍白,粪便干结等表现,基本能体现中医血虚便秘证候;与正常组比较,APH+CPA+DPN三因素建立的血虚便秘模型小鼠外周血RBC、WBC、HGB和HCT均显著降低,排便时间显著延长,排便数量减少,结肠黏膜和腺体萎缩,黏膜层变薄,黏液分泌减少,结肠AQP4和AQP8表达显著升高。3.三个剂量(16.67、8.33、4.17g/kg.d)当归水煎液均能改善模型小鼠血虚便秘证候,均能升高血虚便秘小鼠外周血RBC、WBC、HGB和HCT,缩短排便时间,升高结肠含水量;16.67、8.33g/kg.d的当归水煎液均能升高血虚便秘模型小鼠粪便含水量;三个剂量当归水煎液均能改善血虚便秘模型小鼠的大肠腺萎缩状况,增加结肠黏液分泌,改善结肠润滑功能。4.IHC结果显示三个剂量(16.67、8.33、4.17g/kg.d)当归水煎液均可显著降低血虚便秘模型小鼠结肠AQP4和AQP8的表达;RT-PCR分析结果显示三个剂量当归水煎液均能显著降低血虚便秘模型小鼠结肠AQP4m RNA和AQP8m RNA的表达;WB分析结果显示三个剂量当归水煎液均能显著降低血虚便秘模型小鼠结肠AQP4的表达,16.67、8.33g/kg.d的当归水煎液均能显著降低模型小鼠结肠AQP8的表达。ELISA检测结果显示,血虚便秘模型组小鼠结肠PLC、IP3和Ca M均显著升高,16.67g/kg.d的当归水煎液组小鼠结肠PLC显著降低;三个剂量当归水煎液组小鼠结肠IP3均有降低趋势,但差异无统计学意义;三个剂量当归水煎液组小鼠结肠Ca M均显著降低;血虚便秘模型组小鼠结肠AC、c AMP和PKA均显著升高,三个剂量当归水煎液组小鼠结肠AC、c AMP和PKA均显著降低。5.当归水煎液可改善模型小鼠血虚便秘证候,显著升高小鼠外周血RBC、WBC、HGB和HCT,显著缩短排便时间,升高结肠和粪便含水量;当归多糖可改善模型小鼠血虚证候,显著升高模型小鼠外周血RBC、WBC、HGB和HCT,升高小鼠结肠含水量,但对排便时间无明显影响;当归挥发油可改善模型小鼠便秘证候,显著缩短模型小鼠排便时间,升高粪便和结肠含水量,但对外周血RBC、WBC、HGB和HCT无明显影响。结论:1.中药治疗便秘的临床研究较多,基础研究较少。治疗便秘的中药以复方为主,当归是最常用的核心中药之一。2.APH+CPA+DPN三因素联合建立的血虚便秘小鼠模型基本能体现中医血虚便秘证候,可作为研究血虚便秘的动物模型。模型小鼠外周血液学指标、排便时间、排便数量、结肠黏膜、腺体、黏液分泌及黏膜AQP4和AQP8的表达均有异常改变,可作为研究的评价指标。3.当归可明显改善血虚便秘小鼠的血虚便秘证候、增加结肠和粪便含水量、软化粪便、促进粪便排出,发挥其“润肠通便”功效。4.调节PLC-IP3-Ca M和AC-c AMP-PKA信号通路,进而影响结肠AQPs的表达,抑制近端结肠水分吸收,改善远端结肠黏液的分泌和润滑功能,可能是当归发挥“润肠通便”传统功效的重要机制之一。5.当归多糖和当归挥发油可能是当归发挥“润肠通便”功效的重要组分,但尚不能代表当归的整体效应。
【学位授予单位】：甘肃中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

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基于结肠 AQPs 的表达研究当归“润肠通便”传统功效的药理机制初步检索获得 12906 篇文献，其中万方数字化期刊全文数据库 3267 篇，中国全文数据库 3315 篇，中文科技期刊数据库 3106 篇，中国生物医学文献数据库 3218 去重 9313 篇。在阅读题目和摘要基础上，排除与本研究纳入标准不符的文献 225 共纳入 3368 篇文献。2.2 年代分布1992 年之前每年发表中药治疗便秘的研究论文数量不足 10 篇，1993-2003 年中药治疗便秘的研究论文数量迅速增长，且 2003 年文献量出现第一次高峰（199 篇随后 2004 年的研究数量骤降，2006 年文献量迎来第二次高峰（222 篇），而 2007-年每年发表研究数量介于 153-212 篇之间。结果见图 1。

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图 2 中药治疗便秘研究的省份分布Fig. 2 The province distribution of Traditional Chinese Medicine for constipation刊分布8 篇中药治疗便秘的研究文献刊载在 609 种期刊上，表 1-1 为载文量大疗便秘研究期刊一览表，刊载 19 篇、18 篇、17 篇、16 篇、15 篇、篇、11 篇、10 篇、9 篇、8 篇、7 篇、6 篇、5 篇、4 篇、3 篇、2 篇和分别为 3 种、2 种、3 种、2 种、1 种、2 种、2 种、9 种、3 种、6 种4 种、15 种、25 种、34 种、52 种和 98 种。从期刊的名称来看，中医冠名中药、中医和中医药的期刊 54 种，由此可见，大部分研究刊载杂志上。载 3368 篇中药治疗便秘研究的前 18 位期刊名称一览表[数量（百分比）]The list of the first 18 journals that published 3368 articles on traditional Chinese Ment of constipation[number(percentage)]期刊名称 n(%) 序号期刊名称

发文量,论文撰写,上海中医药大学,西苑

14 / 124图 3 发文量介于 6-21 篇的作者合作社会关系图Fig. 3 The social network diagram of the author cooperative of articles published in the 6-21 作者机构分布及合作关系共有 1607 个机构在参与了 3368 篇中药治疗便秘的论文撰写，共出现 2481 次文数目最多的机构为上海中医药大学药理教研室、中国中医科学院西苑医院、

【参考文献】