固公果根提取物基于Nrf2通路调节实验性溃疡性结肠炎的功效及机制研究

发布时间：2020-07-10 10:39

【摘要】：溃疡性结肠炎(UC)是一种病因尚不明确的直肠和结肠慢性非特异性炎症性肠病,以腹痛、腹泻、粘液脓血便、里急后重等为主要症状,属中医“久泻”、“久痢”、“肠风”等范畴。因其病因不明,发病环节多,缠绵难愈,易癌变,故被世界卫生组织列为现代难治病之一。炎症性肠病在欧美国家多见,但世界各国均有流行且发病率呈上升趋势,我国发病率也在逐年增加。因此寻找有效的治疗溃疡性结肠炎的药物更是我们中医药工作者一项重要任务。固公果是蔷薇科蔷薇属植物固公果Rose odorata Sweet var.gigantea(Coll.et Hemsl.)Rehd.et Wils的根,性平、味酸,具有涩肠止泻的功效,能迅速杀死致病菌,保护消化道黏膜,加快肠壁血液循环,加快溃烂肠黏膜愈合,常用于治疗腹泻、菌痢等疾病,是一味应用历史悠久的彝族民间药材。目前国内外关于固公果根这味彝族药物的研究工作主要是我们课题组完成的。前期工作我们通过去粗取精首次确定了固公果根药材治疗腹泻的有效部位,并在此基础上首次确定了固公果根提取物能够有效地治疗葡聚糖硫酸钠诱发的小鼠溃疡性结肠炎。前期探索性研究还发现其治疗溃疡性结肠炎主要通过降低炎症部位的TNF-a、IL-6的含量,抑制NF-kB的活性,激活Nrf2通路,抵抗炎症,达到抗炎,治疗溃疡性结肠炎的作用。因此本项目基于NF-kB/Nrf2通路研究固公果根治疗溃疡性结肠炎的抗炎机制和物质作用基础。一、利用动物模型评价固公果根提取物基于Nrf2通路调节实验性溃疡性结肠炎的功效及机制研究选用3%的DSS溶液建立小鼠溃疡性结肠炎模型,在给药后第八天断头处死取材(食水重、体重、血样、脾脏、肠段)。使用试剂盒测定氧化应激指标(SOD、MDA、MPO)来评价各组小鼠氧化应激指标的变化,发现与模型组比较,固公果根提取物给药组的氧化应激指标有剂量依赖性的变化,抗氧化能力增强;用ELISA试剂盒测定各细胞因子(IL-1b、IL-6、TNF-α)水平,与模型组比较,固公果根提取物给药组的细胞因子水平显著性降低,炎症状况得到改善;测定各组NOS活力发现固公果根提取物给药组的NOS水平随着剂量的增加而降低,炎症减轻;测量结肠长度及测定脾脏重量,固公果根提取物给药组的结肠长度有剂量依赖性的增长,且结肠内血样物质减少,脾脏重量降低,炎症改善;取结肠组织进行石蜡包埋做HE染色切片,模型组肠壁破坏严重,内有大量炎性细胞浸润充血,固公果根提取物给药组随着剂量的增加肠壁破坏减轻,炎性细胞浸润减少,炎症状况得到改善;取血清和结肠匀浆上清液进行Western-Blot法检测,结果证明固公果根提取物给药组能够发挥抗氧化作用以达到减轻炎症的目的,炎症蛋白NF-kB表达显著性减低。综上所述,说明固公果根提取物能够缓解实验性溃疡性结肠炎,降低溃疡性结肠炎的炎症状况。二、利用炎症细胞体外评价固公果根提取物基于Nrf2通路发挥抗炎效果及机制研究MTT法测定固公果根提取物对RAW246.7细胞的毒性范围,1~400μg/mL范围内的固公果根提取物对RAW246.7细胞无明显的毒性作用,后续实验选取100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL三个浓度进行继续验证;使用LPS以TNF-α含量变化为标准建立炎症模型,确定5μg/mL的LPS刺激RAW246.7细胞;ELISA试剂盒测定细胞因子(IL-1b、IL-6、TNF-α)水平,说明固公果根提取物随着剂量的增加显著性抑制细胞因子水平,炎症减轻;NOS活力随着固公果根提取物剂量的增加而受到抑制,减少了NO促炎因子的释放;收集各组的细胞蛋白进行Western-Blot法检测,Nrf2蛋白表达随着剂量增加而上升,相反的是NF-kB的蛋白表达显著性降低,结果说明固公果根提取物能够增加抗氧化蛋白的表达同时降低了炎症蛋白的表达;引入NF-kB蛋白抑制剂(BAY 11-7082)检测各相关蛋白的表达,发现BAY 11-7082不仅能够抑制NF-kB蛋白的表达,还能够降低Nrf2蛋白的表达。综上所述,固公果根提取物能够抑制LPS诱导的细胞炎症反应,且与抗氧化和炎症通路有关。三、利用结肠癌细胞体外评价固公果根提取物基于Nrf2通路促进细胞凋亡及机制研究MTT法检测固公果根提取物对两种人结肠癌细胞活性的影响,固公果根提取物能够抑制两种人结肠癌细胞的增值,选取0.1mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL的固公果根提取物进行后续实验的探究;DAPI染料是一种能够与DNA强力结合的荧光染料,我们利用DAPI染料观察细胞核的损伤,固公果根提取物给药组能够有剂量依赖性的对结肠癌细胞核造成损伤;流式细胞术是当代最先进的细胞定量分析技术之一,我们利用流式细胞术检测固公果根提取物对结肠癌细胞凋亡率的影响,结果说明,固公果根提取物能够增加结肠癌细胞的凋亡;收集细胞蛋白进行Western-Blot法检测,发现凋亡蛋白Bax随着加量的增加表达也显著性增加,而抑制凋亡的蛋白Bcl-2表达降低,同时发现结肠癌细胞的凋亡与抗氧化蛋白Nrf2相关,细胞凋亡增加而Nrf2蛋白表达显著性降低,两种人结肠癌细胞的结果一致。综上所述,固公果根提取物能够增加人结肠癌细胞的凋亡率。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

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广东药科大学硕士研究生学位论文清测定的结果与结肠组织上清液测定结果保持一致。由图 2-7 可知，与空白较，模型组的 IL-1 的含量是显著性升高的现象；与模型组比较，固公果根物给药组的 IL-1 含量趋势是随着剂量的增加表现出显著性下降趋势。由图可知，与空白组比较，模型组中 IL-6 的含量显著性升高；与模型组比较，固根提取物给药组是随着给药量的增加 IL-6 含量是显著性降低的趋势。上述显示，血清测定的结果与结肠组织上清液测定结果保持一致的趋势，均说明果根提取物能够抑制 3%DSS 诱发的实验性溃疡性结肠炎中血清中、结肠组的细胞炎症因子的增加，从而抑制炎症的发生、发展。A B

溃疡性结肠炎

的细胞炎症因子的增加，从而抑制炎症的发生、发展。A B图 2-6 DSS 诱导溃疡性结肠炎处死后取血清与结肠组织测定 TNF-α 的含量变化Fig2-6 Changes of serum TNF-α and colonic tissue in patients with ulcerative colitis aDSS induced deathC D

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图 2-8 DSS 诱导溃疡性结肠炎处死后取血清与结肠组织测定 IL-6 的含量变化Fig2-8 Changes of serum IL-6 and colonic tissue in patients with ulcerative colitis afteDSS induced deathControl：空白组；Model：模型组；Positive：阳性药组；CSP：肠舒片组；ROE-L：固公根提取物低剂量组；ROE-M：固公果根提取物中剂量组；ROE-H：固公果根提取物高剂量A、C、E 图：血清中 TNF-α、IL-1 、IL-6 含量变化（#P < 0.05,##P < 0.01 vs Control;*P 0.05,**P < 0.01 vs Model）；B、D、F 图：结肠组织匀浆上清液中 TNF-α、IL-1 、IL-6 含量变化（#P < 0.05,##P < 0.01 vs Control;*P < 0.05,**P < 0.01 vs Model）2.3.5 NOS、MDA、SOD、MPO 指标的测定取冻存的血清样本和结肠组织上清液样本按照试剂盒说明进行测定，由图9 可知，与空白组比较，血清和结肠组织模型组的 NOS 含量都达到较高的水平与空白组有显著性差异；与模型组比较，血清与结肠组织的固公果根提取物给组的 NOS 含量随着剂量的增加是显著性降低的趋势。上述结果说明了固公果提取物能够有效降低 NOS 活性，抑制 NO 等促炎因子释放，减轻炎症反应。

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