苏木素抗抑郁作用的实验研究

发布时间：2020-07-10 10:41

【摘要】：目的:抑郁症是一种典型的精神疾病,其发病率逐年增加,致残率高,已成为非常严重的公共卫生和社会问题。氧化应激损伤增加和免疫失调被认为是抑郁症发生发展的重要病理学机制。巴西苏木素(Brazilin),是传统中药苏木的主要活性成分,具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤、血糖调节等多种生物活性,考虑到其抗炎和免疫调节等活性,我们推测苏木素可能具有潜在的神经保护和抗抑郁作用,目前尚未见苏木素与应激诱发的神经损伤和神经行为异常的相关研究报道。H_2O_2是细胞内活性自由基的主要成分之一,外源性H_2O_2常作为细胞氧化损伤的诱导剂,用于氧化应激损伤的体外细胞学实验研究。在应激致抑郁症的发生发展过程中,中枢相关脑区存在氧化应激损伤的增加,抗氧化应激损伤药物能够改善动物的抑郁行为。基于抑郁症与氧化损伤的相关联系,本实验综合利用体外氧化应激损伤细胞模型结合慢性应激(chronic mild stress,CMS)小鼠抑郁模型,探讨苏木素处理对氧化应激损伤和应激诱发抑郁、焦虑行为的影响,为开发基于苏木素的抗抑郁和神经保护药物提供初步实验依据。方法:1苏木素对H_2O_2诱导的细胞损伤的保护作用1.1 MTS法测试不同浓度H_2O_2对体外PC12细胞损伤的影响;1.2 MTS法测试不同浓度苏木素处理对PC12细胞存活率的影响;1.3 MTS法测定不同浓度苏木素预处理对H_2O_2诱导的细胞损伤的保护作用;1.4 Annexin V-FITC/PI法和流式细胞术检测苏木素预处理对H_2O_2刺激诱导的PC12细胞凋亡和坏死率的影响。2苏木素处理对慢性应激诱导的成年小鼠抑郁行为的影响实验小鼠随机分为5组,分别为空白对照组、溶媒对照组、苏木素给药组(3 mg/kg、10 mg/kg)、10 mg/kg氟西汀给药组,每组10只。除空白对照组外其他各组小鼠进行28 d慢性轻度应激(小鼠每天随机进行两种应激处理,应激方式包括:24 h倾斜鼠笼、24 h禁食、24 h禁水、4℃冰水游泳5 min、光照过夜、空笼12 h、潮湿垫料12 h、拥挤24 h、束缚2 h、夹尾1 min等),空白组小鼠放置于另外一个房间正常饲养。慢性应激第28 d开始,应激各组小鼠每日腹腔注射给药,给药结束30 min后行应激处理,持续7 d,末次给药后24 h开始进行行为学测试。开场测试设备为不透明有机玻璃支撑的敞口(40 cm×40 cm)装置。测试时,将小鼠放置于开场中央区域,持续5 min,采用动物行为学跟踪系统和视频分析系统(Smart 3.0)记录5 min内小鼠爬格数和中央停留时间。新颖抑制摄食实验操作方法为小鼠禁食24 h后放入封闭开场(同开场测试所用敞口装置)中,中心区域放鼠粮一颗,从任意箱角放入小鼠,记录小鼠放入开场到开始吃食的时间,随后放回笼中,记录回笼后5 min内的食物消耗量,以排除食欲差异对进食时间的影响。糖水偏爱测试分为糖水适应和测试两个阶段。糖水适应阶段,小鼠分笼饲养适应48 h,每笼同时给予2个装有质量分数1%的蔗糖水水瓶,小鼠自由饮水48 h后,进行基础糖水偏爱测试,小鼠单笼饲养,禁食禁水24 h后,同时给予每只小鼠事先量好的1%蔗糖水和纯水各1瓶,自由饮水24 h后,分别称重,计算消耗量,测试期间12 h左右两水瓶位置互换。糖水偏爱值(%)=蔗糖水摄取量/(饮用水摄取量+蔗糖水摄取量)×100%。结果:1苏木素对H_2O_2诱导的细胞损伤的保护作用1.1经不同浓度H_2O_2处理PC12细胞,MTS法检测细胞存活率,确定采用终浓度为200μM的H_2O_2诱导PC12细胞氧化损伤模型;1.2经不同浓度苏木素处理PC12细胞,MTS法检测细胞存活率,结果显示终浓度0-40μM苏木素处理不显著影响细胞存活;1.3采用苏木素预处理结合H_2O_2共孵育PC12细胞的方法,MTS法结果显示苏木素在浓度10μM和20μM时可逆转H_2O_2处理诱发的细胞存活率下降,差异具有统计学意义(P0.05,P0.01),对H_2O_2诱发的细胞损伤有明显的保护作用;1.4采用苏木素预处理结合H_2O_2共孵育PC12细胞的方法,Annexin V-FITC/PI法和流式细胞术结果显示10μM和20μM苏木素能有效降低H_2O_2诱导的PC12细胞凋亡和坏死率,差异均具有统计学意义(P0.05)。2苏木素对应激诱导的成年小鼠抑郁行为的影响行为学实验结果显示,在不明显影响总饮水量的情况下,CMS处理后生理盐水对照组(38.56±4.01%)较空白对照组(60.77±3.62%)的SPT值有明显差异(P0.01);10 mg/kg苏木素组(72.06±3.35%)和氟西汀阳性药物组(73.16±3.52%)均显著逆转了CMS导致的小鼠蔗糖偏好降低的现象(P0.01),且与空白对照组无明显差异,显示出明显的抗抑郁活性。OFT和NSF的实验结果显示,与空白对照组(60.90±8.43 s,32±2.92 s)相比,CMS处理显著降低了小鼠在OFT中的中央停留时间(25±2.82 s),明显延长了在NSF实验中的摄食潜伏期(76.7±8.26 s),均具有显著的统计学差异(P0.01);在OFT测试中,3 mg/kg苏木素(45.3±7.08 s)逆转了CMS导致的小鼠中央停留时间缩短(P0.05);10 mg/kg苏木素(44.4±8.04 s)及10 mg/kg氟西汀组(53.67±5.88 s)逆转了NSF测试中CMS导致的小鼠摄食潜伏期延长的焦虑样行为,差异具有统计学意义(P0.05,P0.01)表现出了明显的抗焦虑活性。结论:体外细胞实验发现,10μM和20μM苏木素能有效逆转H_2O_2导致的PC12细胞凋亡和坏死情况,增加细胞存活,对氧化应激诱发的细胞损伤具有显著的保护作用。动物行为学结果进一步表明,系统给予苏木素处理能明显逆转CMS诱发的抑郁和焦虑行为,表现出明显的抗抑郁和抗焦虑活性。总之,本研究结果首次证明苏木素具有抗抑郁和抗焦虑作用,其抗抑郁和抗焦虑作用可能与其抗氧化应激损伤有关。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：

细胞活力,苏木素

图 2 不同浓度的 H2O2和苏木素对细胞活力的影响Fig.2 Effects of different concentrations of H2O2and hematoxylin on cellviability.Cell viability was detected by MTS assay. Cytotoxic effects of H2O2(A) andbrazilin (B) on PC12 cells. The cells were treated with H2O2for 24 h or withbrazilin for 36 h with the indicated concentrations. All data are expressed asmeans ± SEM and represent three independent experiments. Bars withdifferent characters indicate statistical difference at P<0.05 level.

细胞毒性,苏木素,PC12细胞,细胞的

图 3 苏木素抑制 H2O2诱导的 PC12 细胞的细胞毒性Fig.3 Brazilin suppressed H2O2-induced cytotoxicity in PC12 cells. Morphological observation. Cells after treatment were observed se contrast microscope (×200). (B) Brazilin attenuated H2O2-inrease of cell survive. The PC12 cells were pre-treated with or wilin for 1 h and co-treated with H2O2for another 24 h. All daressed as means ± SD and represent three independent experiments different characters indicate statistical difference at P<0.05 level.

苏木素,细胞凋亡

20图 4 苏木素对 H2O2诱发的 PC12 细胞凋亡、坏死的影响Fig.4 Effects of brazilin on H2O2-induced apoptosis and necrosis on PC12cells.(A) PC12 cells were exposed to 200 μM of H2O2and different concentrationsof brazilin for 24h. After the treatment, the staining cells with AnnexinV-FITC and PI-labeling were analyzed by flow cytometric. Apoptotic cells (B)and cell necrosis (C) were analyzed. Results are presented as means ± SEM(n=5). **P<0.01, compared with control group, *P<0.05, compared withH2O2-treated group.

【参考文献】