具氢气缓释功能的中药复方多重智能响应纳米给药系统的构建与评价

发布时间：2020-07-10 13:35

【摘要】：噪声性聋是由噪声所诱发的听觉系统损伤,也是最常见的职业性伤害和听力致残因素之一。研究认为,噪声致聋的一个重要机制是耳蜗氧化应激产生了大量活性氧自由基,导致内耳毛细胞的破坏,进而影响了听觉的传输。另一方面,由于线粒体中氧化应激导致氧化呼吸链的中断,使得大量酸性中间代谢产物堆积造成局部酸化。随着中医药现代化的发展,传统中药复方制剂已无法适应中医精准医学的理念和发展,因此,亟待开发新型复方制剂释药系统,实现中药复方制剂现代化。丹参与三七配伍,是临床上常用的药对之一,二者中的活性成分均能够有效清除活性氧自由基,且均能起到预防和治疗噪声性聋的作用。自日本学者首次报道氢气的抗氧化效果以来,氢气对内耳疾病及内耳毛细胞的保护作用也得到广泛研究。目前有研究表明,氢气可减轻内耳毛细胞的氧化应激,对噪声性聋具有良好的防治作用。智能响应型释药系统以其精准化、个体化的独特优势,得到了世界范围内广泛关注及研究。相比于单一刺激响应性系统,针对多种刺激信号的多重响应性系统能够更为精确地控制药物的释放。本课题选择丹参、三七有效组分(丹参酮IIA、三七皂苷R1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1)作为模型药物,针对噪声性聋所造成的氧化应激和局部酸化,设计了以pH响应性纳米碳酸钙(CMCS/CC)为药物载体、以低分子量壳聚糖(CS)为氧化响应性外壳并包载超顺磁性纳米四氧化三铁,集pH、氧化、磁响应性于一体的多重响应纳米给药系统;同时制备载纳米氢化钙的聚乙二醇单甲醚-聚乳酸共聚物(mPEG-PLGA)纳米粒(NPs)以实现氢气的缓慢持续性释放。最后分子对接结果显示,二者可以通过氢键作用相结合,得到三重响应同时具氢气缓释能力的中药多组分复合纳米载药体系。以碳酸钙(CC)为基质、羧甲基壳聚糖(CMCS)为生物矿化抑制剂,采用生物矿化法构建pH响应内核CMCS/CC。考察CMCS不同浓度对CMCS/CC粒径的影响,随着CMCS浓度的增加,CMCS/CC体系的平均粒径随之增加。X射线衍射分析表明,制备得到的CC主要晶型为方解石,平均粒径为39.7 nm;扫描电子显微镜观察证实CMCS/CC为CC的聚集,且总体呈现类球形态;N2吸附脱附实验结果提示CMCS/CC存在37 nm和100 nm左右的单峰,表明CMCS/CC存在多级复孔结构,且通过荧光显微镜观察显示,CMCS/CC微球对于水溶性的罗丹明B和脂溶性的尼罗红,均具有很好的包载性能。尼罗红释放实验表明,CMCS/CC的pH响应性能与CMCS的浓度有关,CMCS浓度为1 mg/m L时,不同pH条件下释药行为相似;当CMCS浓度增大到3 mg/m L以上时,则表现为pH6.0条件下的释药速率最快。通过离子交联法制备CS外壳,首先利用CMCS与CS的电荷吸引将CS吸附于CMCS/CC表面,再利用γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的交联作用,使CS在CMCS/CC表面形成交联结构,以形成稳定的核壳结构,同时在CS外壳中包载超顺磁性纳米粒以实现载体磁靶向性,并在其表面配合铁离子,利用类Fenton反应增强载体的氧化响应性能。粒径分布显示,CS浓度在一定范围内时,粒径分布相比于CMCS/CC变得更加均一,PDI更小,当CS浓度为10 mg/m L时,PDI可低至0.002±0.10(n=3),说明γ-PGA对CS的交联作用,使得作为外壳的CS在CMCS/CC表面更加致密。在CS层包载了超顺磁性Fe3O4纳米粒后,磁滞回线结果提示CMCS/CC-CS表现出良好的磁响应性能。氧化响应性试验表明,CMCS/CC-CS在100 mM H2O2(pH5.0和pH6.0)环境中,尼罗红在6 h内即可释放完全;数学分析表明,100 mM H2O2环境中,CMCS/CC-CS在pH5.0条件下,满足一级释放动力学过程;在pH6.0条件下,满足Ritger-peppas方程,n=1.33,为super case II转运,表明药物的释放与基质的压力、亲水性玻璃态聚合物的相转变或聚合物的解聚、溶蚀有关;在pH7.4条件下,满足Ritger-peppas方程,n=0.503,表明药物的释放同时受到扩散和溶蚀两种作用的控制,且药物的扩散占据主导作用。应用高速机械剪切法制备得到纳米氢化钙,在20,000-30,000 rpm的转速下高速搅拌1 h后纳米氢化钙平均粒径在166.4 nm,PDI为0.268。氢气检测试液测定氢气浓度发现,纳米氢化钙可以在较长时间内维持较高的氢气浓度,在48 h内的氢气浓度可稳定在2.4 ppm以上,具有较长的释氢时程和较高的释氢浓度。采用单乳化溶剂挥发法制备包载纳米氢化钙的mPEG-PLGA NPs,粒径增大到460.2 nm,PDI为0.229。扫描电子显微镜观察其表面纳米形态呈现规整的球形,且分散性好。应用分子动力学模拟及分子对接,理论计算出CMCS/CC-CS与mPEG-PLGA NPs之间可以通过氢键作用相结合,扫描电子显微镜观察到结合形态呈“花生”型,并通过FT-IR、XPS等分析手段证实了氢键的存在。次级键破坏实验表明,CMCS/CC-CS与mPEG-PLGA NPs结合的主要驱动力为氢键作用和(或)疏水作用,静电力起辅助作用。结构稳定性实验表明,该纳米体系在人工内耳外淋巴液中24 h内整体形态无明显变化,且豚鼠体内实验证实其能够穿过圆窗膜,且在内耳外淋巴中有分布,形态有略微变化,但双纳米球的结合形态仍然存在,表明“花生”型纳米体系能转运穿过内耳圆窗膜,并能保持形态完整。采用共孵育方法制备了载复方丹参三七的纳米给药系统。三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、和丹参酮IIA的包封率分别为61.93%、63.96%、94.35%和82.41%。综上,本文研究结果表明,所构建的中药多组分复合纳米载药系统,具有pH、氧化、磁三重响应性能及氢气缓释作用,并能够包载亲水及亲脂性药物;对噪声性聋的预防和治疗具有潜在的应用价值,有望成为新型智能响应型中药复方给药系统。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R283.6
【图文】：

示意图,噪声性聋,示意图

广东药科大学硕士研究生学位论文床推广高压氧疗法，但是此疗法仅对轻中度及病程短的噪声有如基因治疗[20]、干细胞移植[21]等新的治疗手段，但目前临床应用，还将面临诸多困难。虽然噪声性聋的治疗有多特点以及药物自身诸如稳定性、不良反应等缺陷，目前临床重度噪声性聋）的治疗仍然缺乏确切有效的治疗方案。因此策略外，开发新型智能药物载体以达到药物长效、缓释的目聋的当务之急。

示意图,刺激响应性,纳米系统,示意图

广东药科大学硕士研究生学位论文应纳米给药系统[48]。有研究报道了一种基于硫响应纳米粒的报道[49]，通过将具结构稳定性的疏片段相结合，设计出了 ROS/pH 双重响应的胶束条件下的表现为疏水性，而在氧化应激条件下则载亲水及疏水性药物。实验证实，在 H2O2和低蛋白的释放会因纳米粒的降解变得更快。Xu 等物微囊，它具有双重响应能力：N-异丙基丙烯酰聚 2-乙烯基吡啶作为 pH 响应的臂链，单分子胶体，微囊内部可载水溶性大分子，且疏水性和亲从壳和核中连续释放。并且，这种释放顺序是可按相反的顺序释放。

示意图,纳米,示意图,溶酶体

图 1-3 纳米递送系统示意图Fig.1-3 Schematic illustration of the designed NDDS其体内过程推测如下：混合纳米给药系统经鼓室注射，并在外加磁场作用下，定向聚集至圆窗膜部位，并经圆窗膜进入内耳，噪声性聋会导致耳蜗内 OS 的发生，持续的氧化环境会导致组织损伤，此时包载氢化钙纳米粒的 mPEG-PLGA 纳米粒则会因水的缓慢渗透作用而缓慢释放氢气，从而维持环境中的氧化还原平衡。由于 ROS 的产生部位为线粒体，因此在损伤毛细胞周围的氧化电位较高且 pH 较低，具 pH/氧化响应性的纳米粒则会定向聚集于损伤细胞周围，并被细胞所吞噬，通常细胞吞噬会形成吞噬小体，最终形成溶酶体将外源性物质降解，但由于 pH 响应性内核基质为碳酸钙，在溶酶体的酸性环境中，碳酸钙被降解，释放钙离子，由于钙离子可破坏溶酶体，因此可促使内核中的抗氧化药物进行溶酶体逃逸[93]，从而在包浆、线粒体、细胞核等处发挥直接治疗作用。另一方面，由于外壳中纳米 Fe3O4的存在，通过核磁共振成像，即可判断出损伤部位，为进一步治疗提供明确方向。

【参考文献】