固本化瘀通络合剂含药血清对高糖环境下足细胞损伤、凋亡及自噬的影响及分子机制研究

发布时间：2020-07-10 21:48

【摘要】：目的:基于“足细胞损伤是糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)发生的关键性病理改变,自噬异常是足细胞损伤的病理学基础”的观点,本研究通过观察固本化瘀通络合剂含药血清对高糖环境下足细胞的损伤、凋亡和自噬情况,探讨该含药血清是否及如何调节高糖所致的足细胞自噬异常,维持足细胞的形态和数量,减轻足细胞损伤,为DN提供新的防治靶点。方法:参照《中药药理研究方法学》的动物剂量换算公式,将SD雄性大鼠给予生理盐水和不同浓度的固本化瘀通络合剂灌胃,获得空白组大鼠血清、2倍等效剂量含药血清和4倍等效剂量含药血清。第一部分:取对数生长期的足细胞种植于细胞培养板中,置37℃、5%CO_2培养箱中培养至分化成熟;将分化成熟的足细胞随机分为正常对照组(5.5mmol/L葡萄糖+空白组大鼠血清)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖+空白组大鼠血清)、低浓度含药血清组(30 mmol/L葡萄糖+2倍等效剂量含药血清)和高浓度含药血清组(30 mmol/L葡萄糖+4倍等效剂量含药血清)。本研究通过观察24 h、48 h和72 h时足细胞的形态学变化,并结合CFSE/PI双染实验对细胞死亡率进行检测,以确定固本化瘀通络合剂含药血清对高糖环境下足细胞的最适作用浓度。第二部分:将细胞随机分为对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+空白组大鼠血清)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖+空白组大鼠血清)和中药组(30 mmol/L葡萄糖+2倍等效剂量含药血清),用流式细胞术检测不同培养条件下足细胞的凋亡水平,逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测nephrin mRNA表达,蛋白印迹法(Western Blotting,WB)检测nephrin蛋白表达。第三部分:用免疫荧光检测不同培养条件下足细胞的P62/SQSTM1的表达,pGMAD-CMV-RFP-GFP-hLC3腺病毒转染检测微管相关蛋白1的轻链3(microtubule-associated protein1 light chain3,MAP-LC3或LC3)的表达,RT-qPCR检测LC3B、P62、atg5、atg7、atg12、AMPK(AMP-activated protein kinase,腺苷酸活化的蛋白激酶)和mTOR(mammalian target of rapamycin,雷帕霉素靶蛋白)mRNA的相对表达量,Western Blotting检测LC3-I、LC3-II、P62、Atg7、Atg12-Atg5、AMPK、p-AMPK、mTOR和p-mTOR的蛋白表达。结果:第一部分:正常对照组足细胞贴壁生长于培养孔板底部,细胞呈树枝状或星形;高糖组足细胞不同程度地出现皱缩,伴有足突变短、融合或消失;与高糖组相比,低浓度含药血清组的足细胞形态有明显改善,但高浓度含药血清组的足细胞足突更加短小,脱落的足细胞数量更多。CFSE/PI染色:低浓度含药血清能减少高糖所致的足细胞死亡率,而高浓度含药血清组足细胞的死亡率比高糖组明显增加。因此,我们选择低浓度(2倍等效剂量)含药血清进行后续实验。第二部分:48h和72h时,与对照组相比,高糖组足细胞凋亡率增高;与高糖组相比,中药组凋亡率明显降低。RT-PCR和Western Blotting检测:在各个时间点,高糖组足细胞nephrin mRNA及蛋白表达量与对照组相比,均明显下降;与高糖组相比,中药组足细胞nephrin mRNA及蛋白表达量明显升高。第三部分:(1)免疫荧光检测:24h时,高糖组绿色荧光颗粒较对照组明显增多,与高糖组相比,中药组的绿色荧光颗粒有所减少;这种趋势在48h和72h时变得越来越明显。(2)腺病毒转染检测LC3的表达:与对照组相比,高糖组足细胞内黄色和红色荧光颗粒数量均明显减少,与高糖组相比,中药组足细胞内黄色和红色斑点均明显增多。(3)RT-PCR检测和Western Blotting检测:在三个时间点,LC3B、atg5、atg7、atg12、P62和mTOR的mRNA和蛋白、p-AMPK的蛋白相对表达量进行组内比较,均有显著差异性,但AMPK mRNA和蛋白表达量、p-mTOR的蛋白表达量均未见明显变化。结论:(1)高糖引起足细胞形态学改变,诱导足细胞死亡;低浓度固本化瘀通络合剂含药血清能改善高糖环境下的足细胞形态,降低死亡率;高浓度含药血清对高糖环境下的足细胞未见保护作用,相反,导致足细胞死亡率增高。(2)固本化瘀通络合剂含药血清能在一定程度上抑制高糖诱导的足细胞损伤和凋亡,维持足细胞的形态及功能,这可能与其调节足细胞自噬异常有关。(3)高糖抑制足细胞自噬活性,固本化瘀通络合剂含药血清可能通过增加p-AMPK水平、降低mTOR的表达,进一步调节AMPK和mTOR信号通路,促进自噬小体的形成和自噬底物的降解,改善高糖环境下足细胞的自噬异常,抑制足细胞损伤和凋亡,从而发挥保护足细胞的作用。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

足细胞,培养条件,乙酸基

图 1-1. 不同培养条件下足细胞的形态学改变（ 200）2.2 不同培养条件下足细胞 CFSE/PI 染色结果CFSE（carboxyfluorescein succinimidyl amino ester，羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯），其含有两个乙酸基团和一个功能基团，当其以此种形式存在时，不具备荧光性质，却具有高度的膜穿透性而自由进入活细胞；当其扩散进入细胞后，内源性酯酶将乙酸基团水解使其具备很高的荧光活性，却不再具有膜通透性，最终形成具有荧光的蛋白复合物，在 490 nm 波长的激发光下，分组处理前所有存活细胞的胞质被 CFSE 染色呈现绿色荧光。PI（Propidium Iodide，碘化丙啶），是一种 DNA 荧光染料，其分子量大而不能通过正常细胞的完整细胞膜，早期凋

足细胞,培养条件,含药血清,细胞膜

成都中医药大学博士学位论文亡的细胞由于仍然保持着细胞膜的完整性，因此也无法被 PI 染色；而晚期凋亡的细胞和死细胞的细胞膜完整性丧失，PI 能穿过破损的细胞膜将其 DNA 染色，在 536 nm 波长的激发光下，凋亡和坏死细胞的胞核被 PI 染色呈现红色荧光。实验结果显示：在细胞培养的不同时间点，各组细胞的绿色荧光强度、数量及分布情况无明显差异。在培养 24h 时，正常对照组、高糖组和低浓度含药血清组细胞的红色荧光比例及强度均未见明显差异，与高糖组和低浓度含药血清组比较，高浓度含药血清组的红色强荧光明显增多（图 1-2，表 1-1）。

足细胞,培养条件,死亡率,含药血清

图 1-3. 48 h 时，不同培养条件下足细胞 CFSE/PI 染色结果（ 100）注：所有存活细胞的胞质被CFSE染色呈现绿色荧光，凋亡和坏死细胞的胞核被PI染色呈现红色荧光。细胞培养 72 h 时，不同培养条件下细胞死亡率的变化趋势与 48 h 时一致（图 1-4，表 1-3）。结果说明，培养 48 h 和 72 h 时，低浓度固本化瘀通络合剂含药血清能降低高糖诱导的足细胞死亡率，差异有统计学意义（P<0.05）；而高浓度含药血清反而使高糖环境下的足细胞死亡率增高（P<0.05）。

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