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黄连解毒汤通过改善肠道激素及肠道菌群延缓IGT大鼠2型糖尿病的发生机制

发布时间:2020-07-11 06:41
【摘要】:目的随着生活方式的改变、社会老龄化的不断进展,糖尿病发病率不断提高。如何有效预防及延缓其发病已成为医疗卫生工作的重中之重。革兰氏阴性菌细胞壁成分之一——脂多糖(LPS)水平在血浆内的升高(内毒素血症),已被证实与2型糖尿病(T2DM)慢性炎症反应息息相关,而肠道激素、肠道菌群及肠道黏膜屏障在T2DM发病中的地位也逐渐得到重视。本研究选用瘦素受体突变而自发2型糖尿病大鼠——ZDF大鼠(Zucker Diabetic Fatty rat,fa/fa),于糖耐量减退阶段(IGT)进行药物干预,以观察黄连解毒汤对糖耐量减退ZDF大鼠2型糖尿病发病的预防和(或)延缓作用并探讨相关机制。方法SPF级雄性ZDF大鼠20只,以高脂饲料Purina#5008诱导至IGT期后,随机分组至模型组或黄连解毒汤干预组(黄连组),每组各10只,并以正常ZL(Zucker Lean rats,fa/+)大鼠5只作为正常组对照。其中,黄连组以黄连解毒汤0.075g/d灌胃干预,模型组及正常组以同体积双蒸水对照,每周行口服糖耐量实验(OGTT)确定大鼠患病情况,以模型组全部发展至糖尿病为实验终点,再次行OGTT比较各组糖尿病发病率。实验过程中,每周记录大鼠血糖、体重、进食量等一般情况变化,留取糖耐量正常期(NGT)、IGT期及T2DM各时期血,以酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆胰岛素(INS)、胰高血糖素(GC)、脂多糖(LPS)、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)及胰高血糖素样肽-2(GLP-2)等水平,并以HOMA-IR指数评价胰岛素抵抗;测定大鼠血脂水平、肝肾功以检测黄连解毒汤对血脂改善情况并评估药物副作用。留取各时期各组大鼠新鲜粪便标本,以16Sr DNA高通量测序方法观察肠道菌群结构的改变。实验结束后处死动物留取新鲜肠道组织,评价大鼠肠道L细胞分泌GLP-1、GLP-2能力,观察光镜下各组肠道黏膜形态改变情况,以免疫组化方法观察不同组间回肠occludin、ZO-1、TLR-4、NF-κB和TNF-α的表达。结果1.糖尿病发病率:对6周龄各组大鼠予高脂饲料Purina#5008诱导饲养后,ZDF大鼠于9周龄左右全部发展至糖耐量减退阶段(IGT),12周龄(药物干预3周)时,全部模型组大鼠发展为糖尿病(DM),而此时黄连组大鼠仅有50%进展为DM,另有50%的大鼠糖耐量恢复正常。2.一般情况:药物干预开始后,各时期黄连组体重均低于对照组(P均0.05);干预2周后,黄连组大鼠进食量显著下降(P均0.05);药物干预3周后,与模型组相比,黄连组空腹血糖及糖耐量各时点血糖显著降低(P均0.01)。3.ELISA测定血浆各指标水平:随病程进展,ZDF大鼠空腹血浆胰高血糖素(P0.01)、胰岛素抵抗水平(P0.01)、LPS水平(P0.05)、GLP-1(P0.01)水平逐渐升高,而胰岛素、GLP-2(P均0.01)水平逐渐下降。药物干预3周后,与模型组相比,黄连组空腹血浆胰岛素水平(P0.05)、胰岛素抵抗水平(P0.01)、胰高血糖素水平(P0.05)、脂多糖水平(P0.01)均有不同程度下降,GLP-1(P0.05)水平进一步增加,而空腹血浆GLP-2水平未见明显改变。4.肠道L细胞分泌GLP-1、GLP-2能力:药物干预3周后,较正常组,模型组及黄连组肠道L细胞分泌GLP-1能力明显提高,黄连组更为明显(P均0.05);而模型组肠道分泌GLP-2水平较正常组有所下降,黄连组对肠道L细胞分泌GLP-2能力具有改善作用。5.HE染色观察肠道黏膜形态:糖尿病大鼠肠道黏膜形态破坏,可见肠绒毛排列杂乱、形态不规则增宽及融合,较多炎细胞浸润于固有层;黄连解毒汤干预组大鼠肠道黏膜形态有所改善。6.免疫组化:与正常组相比,模型组回肠TLR-4、NF-κB和TNF-α(P均0.01)的表达增加,回肠occludin及ZO-1(P均0.01)表达明显减少;而黄连组上述指标均有明显改善(P均0.01)。7.16Sr DNA高通量测序观察肠道菌群结构变化:1)各干预组内粪便样本间具有高度相似性,而各组间肠道菌群结构具有明显差别(P0.05);2)较正常组,模型组肠道菌群丰度及物种多样性均出现显著下降,黄连解毒汤对此有显著改善作用(P均0.05);3)在门的水平,各组大鼠肠道菌群主要组成成分均为拟杆菌门(Bacteroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes),其次为变形菌门(Proteobacteria)与疣微菌门(Verrucomicrobia)。与正常组相比,糖尿病大鼠肠道菌群中拟杆菌门的相对丰度显著增加,而厚壁菌门相对丰度则相对减少;于IGT期对大鼠应用黄连解毒汤干预3周后,这一趋势得到有效遏制。在属水平,药物干预使肠道菌群中拟杆菌属(Bacteroides)、颤螺菌属(Oscillospira)、Akkermansia、凝聚杆菌属(Aggregatibacter)、梭菌属(Clostridium)、罗氏菌属(Roseburia)和真杆菌属(Eubacterium)相对丰度明显增加,而作为模型组肠道菌群主要成分的普雷沃菌属(Prevotella),在黄连组中比例显著减少。在种水平,与正常组相比,糖尿病大鼠粪便菌群中普氏菌(Prevotella copri)比例明显上升,Akkermansia_muciniphila、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus_reuteri)和粪拟杆菌(Bacteroides_caccae)相对丰度显著下降,黄连解毒汤对肠道菌群结构明显改善。8.生化指标检测:3周的黄连解毒汤干预对肝功能无明显影响(P0.05);与正常组相比,模型组与黄连组血尿素氮(BUN)升高(P0.05)、血肌酐下降(P0.01),黄连解毒汤有效降低了血尿酸(UA)水平,改善了血脂水平。结论1.对6周龄ZDF大鼠予高脂饲料Purina#5008诱导饲养后,大鼠于9周龄左右发展至糖耐量减退阶段(IGT),12周龄时,发展为糖尿病(DM)。2.于IGT阶段予黄连解毒汤干预,对ZDF大鼠有延缓T2DM发病的作用。可能机制有:1)通过促进肠道L细胞GLP-1分泌,减少进食量,改善胰岛功能,减轻胰岛素抵抗;并降低肠道炎症,保护肠道黏膜屏障,减少LPS入血,降低机体慢性炎症反应水平;2)显著升高糖尿病大鼠空腹血浆GLP-1水平,改善胰岛素抵抗及糖代谢紊乱;3)通过促进肠道L细胞GLP-2分泌,减少肠道黏膜屏障损伤,减少LPS入血,降低机体慢性炎症反应水平;4)通过改善肠道菌群结构,调整有益菌及致病菌比例,促进机体能量收支平衡;减少LPS生成,保护肠道黏膜屏障,降低机体慢性炎症反应水平。3.黄连解毒汤干预未表现出明显的肝肾功毒副作用,并可改善糖尿病大鼠高脂血症。
【学位授予单位】:天津医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285.5
【图文】:

空腹血糖水平,体重,大鼠,黄连


21注:与模型组相比 a:P<0.05,aa:P<0.01;与黄连组相比 b:P<0.05,bb:P<0.01。图 4 各组大鼠不同时间空腹血糖水平及体重的变化

不同时期,大鼠,血糖,糖负荷


天津医科大学硕士学位论文 结2.1.3.糖耐量及曲线下面积随病情进展,可见糖负荷后各时间点血糖逐渐增加(F=144.326,P<0.05AUC 增大。药物干预前,各组大鼠糖耐量无显著差异(P>0.05)。干预 3 周与模型组相比,黄连组各时点血糖显著降低(F=74.358,P<0.01)(图 5)。

胰高血糖素,胰岛素,不同时期,大鼠


23注:与模型组相比 a:P<0.05,aa:P<0.01;与正常组相比 b:P<0.05,bb:P<0.01。与-3 周相比 c:P<0.05,cc:P<0.01;与 3 周相比 d:P<0.05,dd:P<0.01。-3周:干预前 3 周,基线期;0 周:药物干预前 0 周;3 周:药物干预后 3 周。图 6.模型组大鼠不同时期及干预三周后各组胰岛素、胰高血糖素、HOMA-IR改变

【参考文献】

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本文编号:2750085

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