齐墩果酸对赭曲霉毒素A诱导的HEK293T细胞自噬及凋亡的影响

发布时间：2020-07-11 15:11

【摘要】：目的:本实验选用人胚肾上皮细胞(HEK293T)作为研究对象,研究赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)对细胞形态、活性氧水平、自噬相关蛋白、凋亡相关蛋白的影响。并探讨齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)不同干预方式对OTA暴露后HEK293T细胞自噬及凋亡的影响。方法:1.细胞培养:人胚肾上皮细胞(HEK293T)培养,贴壁生长后取对数生长期细胞传代培养后用于后续实验。2.分组处理:实验分为6组,对照组、OTA组、OA组、OA预处理组(即P组,OA先处理+OTA后处理)、OA与OTA同时处理组(即M组),OA后处理组(即L组,OTA先处理+OA后处理)。OTA处理细胞24小时,OA处理细胞2小时。分组处理完成后收集细胞检测。3.流式细胞术检测活性氧水平:分组处理后,收集细胞,加入DCFH-DA探针,无血清培养基洗涤三次,流式细胞仪检测。4.蛋白免疫印记(Western blot):分组处理后提取细胞蛋白,BCA法测定浓度,检测相关蛋白的表达情况。5.数据处理:采用SPSS18.0软件,结果描述用均数±标准差((?)±s)表示,多组间均数比较时,满足方差齐性检验,采用单因素方差分析,并采用SNK法进行两两比较。p0.05表示差异有统计学意义。结果:1.CCK8法结果提示:OA浓度选择,与对照组比较,OA(1μΜ)明显促进HEK293T细胞的增殖(P0.05)。分组处理中,与OTA组比较,OA预处理组(P组)、OA与OTA同时处理组(M组)、OA后处理组(L组)细胞存活率均增加(P0.05)。2.倒置显微镜下观察到:与对照组比较,OTA(8μM)处理24小时后细胞形态发生变化,部分细胞由梭形变成圆形,边缘不清晰,细胞皱缩。与OTA组比较,OA后处理组细胞皱缩情况改善。3.流式细胞术检测结果提示:与对照组相比,OTA组细胞内ROS含量升高(P0.05)。与OTA组比较,P组和L组ROS含量显著降低(P0.05),M组ROS含量降低但无显著差异(P0.05)。4.Western blot结果提示:与对照组比较,OTA组HEK293T细胞内的p-m TOR和p-p70s6k的磷酸化水平降低(P0.05),LC3-II和P-Beclin1的蛋白表达增加(P0.05)。与OTA组比较,OA干预后p-m TOR和p-p70s6k磷酸化水平增加,LC3B和p-Beclin1的表达降低(P0.05),其中OA后处理方式效果较好。5.Western blot结果提示:与对照组相比,OTA组Caspase-9、Bak、Bax、Cyt C蛋白表达量增加(P0.05)。与OTA组比较,P组、M组和L组的Bak、Cyt C表达量降低(P0.05),M组和L组Bax表达量降低(P0.05)。结论:1.OA可以降低OTA诱导的HEK293T细胞氧化应激和细胞凋亡。2.OA通过p-m TOR/p-p70s6k/p-Beclin1/LC3B信号降低OTA诱导的细胞自噬水平,OA后处理效果较好。3.OTA诱导的自噬在一定程度上抑制了细胞的过度凋亡。
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【图文】：

前 言由丝状真菌种产生的曲霉菌属和青霉属的次赭曲霉毒素 A、B、C，其中赭曲霉毒素 A（，仅次于黄曲霉素。OTA 是一个慢性毒素，农产品（谷物、咖啡、可可、干果、香料的谷类、水果、动物饲料的污染物[2]。OTA，很少的游离部分能够排出体外，这些都将 OTA 暴露能够导致肝肾毒性[4]，甚至致畸，明，OTA 暴露与巴尔干地方性肾病有关[5-7]，通过调节不同信号转导途径，导致细胞持甲基化结构形态[9]而损伤肾细胞。目前赭曲待进一步研究。

图 1-2 OA 的分子结构: Chemical structures of Oleanolic acid一些肾脏疾病的发病机制，例如巴的肾肿瘤[21,22]、突尼斯[23]和其他症研究机构（IARC）的数据表明许多食品和饲料中，被美国国家癌齿动物中最有效的肾脏致癌物之一 OTA 的积累、抑制 OTA 的摄取。亡、自噬性死亡、坏死三种类别态下细胞自噬水平较低，在存在细胞死亡。自噬的三种类型（大大自噬。大自噬负责降解受损细

图 2：不同浓度 OA 处理后细胞存活率（ ±s，n=5）ge viability of cells exposed to OA over 2 h. Different lowercase significant differences (P < 0.05)的细胞存活率理方式下对细胞存活率的影响，CCK8 检测对照组、O 组细胞存活率。结果显示：与对照组比较，OTA 组TA 组比较，OA 干预后的三种处理方式增加细胞活）（图 3-A）。M 组细胞存活率最高，推测原因是与 P ，细胞丢失少，整体活性增加。析因结果显示：OTA具有交互作用，（F=34.587，P<0.001）（图 3-B）。

【参考文献】

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10 林丽莎;张s

本文编号：2750572