表没食子儿茶素没食子酸酯对3T3-L1脂肪细胞氧化应激和炎症的作用及其机制研究

发布时间：2020-07-12 05:11

【摘要】：研究背景:肥胖是一种多因素引起的慢性疾病,近年来随着人们生活水平的提高和营养条件的改善,肥胖成为全球范围、尤其是以工业化国家为主所关注的公共健康问题。肥胖被定义为由于脂肪细胞的增生和肥大,从而导致脂肪过量和脂肪组织过度堆积的一种状态。脂肪组织不止是储存脂肪的器官,也是调节内分泌代谢的重要场所,可以分泌瘦素(Leptin)、单核细胞趋化蛋白-1(Monocyte Chemotactic Protein-1,MCP-1)和白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)等因子,这些因子与许多生理和病理过程有关。肥胖者体内伴随着慢性炎症反应和氧化应激反应,这些进而诱导细胞损伤、功能失调和胰岛素敏感性下降,导致一系列病理反应。因此,针对脂肪组织氧化应激和炎症及其分子机制的研究为肥胖及相关疾病的防治提供新的作用靶点。表没食子儿茶素没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate,EGCG)是绿茶中最丰富且最具有活性的成分,EGCG对肥胖的防治作用已被大量研究所证实。同时也有越来越多的研究表明,EGCG具有很强的抗炎抗氧化作用。但是EGCG是否能直接作用于脂肪细胞并具有抑制脂肪细胞炎症和氧化应激的潜力以及相关作用机制,目前鲜有研究报道。本研究拟以3T3-L1脂肪细胞为研究对象,观察EGCG对3T3-L1脂肪细胞氧化应激和炎症水平的影响,并初步探索EGCG对3T3-L1脂肪细胞Nrf2/HO-1的作用,为以氧化应激和炎症为靶标治疗肥胖及相关慢性病提供理论依据。目的:1.了解EGCG对基础状态和脂多糖(LPS)诱导后3T3-L1脂肪细胞氧化应激水平和炎症水平的影响;2.以Nrf2为靶点,初步探索EGCG调控脂肪组织氧化应激和炎症的分子机制。方法:采用3T3-L1前体脂肪细胞,经诱导分化为成熟的脂肪细胞后模拟如下两种状态,并采用不同ECGC予以干预:1)3T3-L1脂肪细胞不作特殊处理的基础状态:用(0μg/ml(空白组))、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml EGCG干预分化成熟的3T3-L1脂肪细胞24h;2)采用LPS诱导3T3-L1脂肪细胞炎症状态:用(0μg/ml(LPS对照组))、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml EGCG预处理2h后,加1μg/mL LPS干预24h。检测如下指标:1.氧化应激水平的检测:采用TBA法、羟胺法和分光光度法分别检测不同浓度的EGCG对上述两种状态下的3T3-L1脂肪细胞内氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽(GSH)活性、丙二醛(MDA)含量;2.炎症水平的检测:1)酶联免疫吸附法(ELISA法)检测不同浓度的EGCG对基础状态和LPS诱导后3T3-L1脂肪细胞上清液中相关炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子a(TNF-a)、单核细胞趋化蛋-1(MCP-1)含量;2)实时荧光定量PCR法检测不同浓度的EGCG对上述两种状态下的的3T3-L1脂肪细胞内炎症因子IL-6、TNF-a、MCP-1mRNA表达量;3.采用实时荧光定量PCR法检测不同浓度的EGCG对上述两种状态下的3T3-L1脂肪细胞核转录因子相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶-1(HO-1)mRNA表达量。结果:1.无论基础状态或LPS诱导的状态下,1μg/ml~50μg/ml EGCG干预均显著降低成熟3T3-L1脂肪细胞的MDA含量(P0.05),显著提高SOD和GSH活性(P0.05),且均呈剂量依赖关系,其中50μg/ml EGCG作用对上述三个氧化应激指标最显著,基础状态下50μg/ml作用浓度与空白组比较结果如下:MDA0.84±0.37 vs 3.01±0.99;SOD 143.17±14.18 vs 68.69±5.32;GSH 308.12±85.16vs 148.87±14.65;LPS诱导状态下50μg/ml作用浓度与LPS对照组比较结果如下:MDA 1.30±0.05 vs 9.81±0.10,SOD 188.35±13.87 vs 46.12±3.44;GSH366.60±60.40 vs 121.20±0.31。2.无论是基础状态或LPS诱导的状态下,1μg/ml~50μg/ml EGCG干预均对成熟3T3-L1脂肪细胞的炎症因子IL-6、TNF-a、MCP-1的mRNA表达量和分泌量均有显著的降低作用(P0.05),且均呈现一定的剂量依赖关系,其中50μg/ml EGCG干预效果最为明显:基础状态下50μg/ml作用浓度与空白组比较结果如下:IL-6 272.59±6.61 vs 216.73±22.81,MCP-1 1021.68±150.09 vs 2134.83±210.42,TNF-a 4.01±1.03 vs 10.33±1.18;LPS诱导状态下50μg/ml作用浓度与LPS对照组比较结果如下:IL-6 107.94±26.22 vs 272.59±6.61,MCP-1 1009.93±37.34 vs 2299.46±93.99,TNF-a 5.53±2.07 vs 18.51±0.49。3.无论是基础状态或LPS诱导的状态下,10μg/ml~50μg/ml EGCG干预均显著提高成熟3T3-L1脂肪细胞的Nrf2和HO-1的mRNA表达量(P0.05)。且均呈现一定的剂量依赖关系。且50μg/ml EGCG干预效果最为明显。结论:EGCG具有抑制3T3-L1脂肪细胞和LPS诱导的3T3-L1脂肪细胞的氧化应激和炎症水平作用,EGCG抑制3T3-L1脂肪细胞氧化应激和炎症的作用可能与上调Nrf2/HO-1有关。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

信号通路

是公认的抗炎介质[75]。HO-1 通过作用相应的靶组织胖个体的早期低度炎症反应，可能成为新的更为有 Nrf2 /ARE 通路的作用化应激水平和炎症水平和表达的降低可能是改善施。EGCG 具有较强的抗氧化抗炎活性，能够通过胞凋亡、抑制脂肪合成和促进脂肪分解等机制发挥路是最为重要的机体内源性抗氧化和氧化应激损伤么，EGCG 是否通过 Nrf2 /ARE 通路来调节脂肪细尚无研究报道。本研究拟以 3T3-L1 脂肪细胞为研1 脂肪细胞氧化应激和炎症水平的影响，并初步探 Nrf2/HO-1 的作用，为以氧化应激和炎症为靶标治论依据。

分子式,炎症,细胞氧化,氧化应激

本研究拟以 3T3-L1 脂肪细胞为细胞氧化应激和炎症水平的影响，并初步f2/HO-1 的作用，为以氧化应激和炎症为靶据。图 1 Nrf2-ARE 信号通路图

诱导分化,时间线,培养液

中的细胞长到 90％左右时第二次传代接种另一块培养板。（4）细胞冻存收集、离心细胞同上，以冻存液（含 90%FBS 和 10%DMSO）重悬细胞沉淀细胞计数板计数后，按 107个/ml 浓度移入冻存管。将冻存管放入程序冷冻盒中置于-80℃冰箱，24 小时后放在液氮罐中保存。（5）细胞分化3T3-L1 前体脂肪细胞生长至接触抑制 2 天后，将细胞培养液换成分化诱导液 I（含 0.5 mM IBMX、1μM 地塞米松、10 μg/ml 胰岛素、10%FBS 的 DMEM培养液）培养 48 小时后，换以分化诱导液 II（含 10 μg/ml 胰岛素、10%FBS 的DMEM 培养液）培养 48 小时，再换以含 10%FBS 的 DMEM 培养液继续培养，天换液一次，当诱导分化 8 天的细胞，在显微镜下能看到细胞内有大量的脂滴形成，表明 90%以上呈成熟脂肪细胞，可用于后续实验（见图 3）。

【参考文献】