基于斑马鱼药物筛选平台对中药复方及其药物靶点的研究

发布时间：2020-07-12 08:15

【摘要】：目的:本课题旨在通过应用斑马鱼数字化药物筛选平台,观察菟丝煎对斑马鱼睡眠昼夜行为学表型的影响,并通过斑马鱼药效指纹图谱进行行为学表型比对,探讨菟丝煎不同复方及由复方拆解的不同药物组合对于失眠治疗的共性作用和差异性的效应物质基础,以期为中医“同病异治”提供客观依据。通过聚类分析、相关性对比分析,探究菟丝煎的组方规律,同时通过与已知靶点的化合物数据库进行靶点拟合,以探讨复方及单药的可能作用靶点与作用机制。为处方优化及新药发现提供理论依据,探索中药复方和单药研究的新途径。方法:采用斑马鱼药物筛选平台,将4Dpf的野生型斑马鱼幼鱼用加样枪逐个加入96孔板中,然后根据药物分组每孔用移液枪加入配置好浓度的干预药物,空白组加入等量的含甲基蓝的Holt Buffer培养液,放置在幼鱼观察行为仪装置中待观察。打开与斑马鱼行为记录仪及恒温水浴箱,设置水浴温度为恒温28.5摄氏度,设置好斑马鱼行为记录仪的相关参数后,开始实验,斑马鱼自动成像系统自动记录相关数据。48小时后,实验结束,输出所记录的数据,通过R软件编程处理后得到以六个行为学指标排列的数据,通过单因素方差分析、聚类分析、相关分析等数据处理方法展现斑马鱼在行为学表型、聚类规律、相关性的强弱等分析其可能作用靶点与可能作用机制。结果:菟丝煎不同剂量及不同药物组合对斑马鱼六个行为学指标的影响呈现多样性,但其正常的睡眠/觉醒节律均存在。聚类分析中菟丝煎低剂量组首先与茯苓远志枣仁高剂量组聚在一起再与褪黑素组、菟丝煎中剂量与高剂量组、茯苓远志枣仁低剂量和中剂量组、人参当归山药炙甘草中剂量和高剂量组先后聚成一大类。菟丝子鹿角霜高中低剂量组和人参当归山药炙甘草低剂量组组成另外的一大类。菟丝煎低剂量组与茯苓远志枣仁中剂量组、茯苓远志枣仁高剂量组具有较高相似性;菟丝煎中高剂量组与茯苓远志枣仁低中高剂量组剂量组、人参当归山药炙甘草高剂量组之间具有较高相似性;菟丝子鹿角霜低剂量组与人参当归山药炙甘草低剂量组具有较高相似性。剂量相关性分析显示,除了菟丝煎中剂量组和高剂量组有较强相关性外,其余都没有明显的相关性。靶点拟合中复方及各组方所涉及的神经受体主要有7类,分别为肾上腺素受体,五羟色胺受体、多巴胺受体、γ氨基丁酸受体、褪黑素受体、抗组胺受体、谷氨酸受体,所涉及的相似药物有24种,具有相似性的药物多具有镇静作用,少部分具有双向调节和剂量依赖性。结论:不同剂量的复方、药组及单药的功效是通过不同靶点综合作用的结果,且各复方及药组剂量不同其作用的靶点也存在差异,这可能与不同药物组合煎煮后发生的有效成分析出的变化有关。斑马鱼幼鱼行为学的多样性及聚类分析结果是建立在中药复方具有多成分多作用靶点特点的基础上的。菟丝煎治疗失眠的机制可能与其作用于多种具有镇静作用生物靶点有关。菟丝煎低剂量组呈晚上抑制,白天无明显影响,符合人类昼精夜寐的生物节律特点,故在临床上其治疗表现为昼不精夜不寐的心脾气弱型失眠效果良好。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285;R-332
【图文】：

示意图,斑马鱼,幼鱼,运动分析

新药提供极大便利。同时也为中药复方的作用机制研究、类方间的作用研究优化研究提供了新思路。斑马鱼行为数据的采集与处理逡2.1.1 斑马鱼行为数据的采集实验前打开斑马鱼行为仪和水浴恒温装置，设置水浴温度为恒温 28.5 摄氏度与斑马鱼行为记录仪相连接的电脑，将提前放置好幼鱼和药物的 96 孔板按心放置在幼鱼实验装置孔板槽内，关上挡板门，点击行为仪程序图标，进入板页面，用鼠标拖动选中所有孔，并双击第一个孔进入设置孔板每孔参数设观测范围：先设定左上、右上、右下圆孔然后的点击（build）按钮即可建孔的观测范围。然后设定最大运动速度、最小运动速度、设定最小探测阈值色、最小活动阈值、不动活动阈值；设置实验总时间为 48 小时，白昼和黑替参数：开灯时间（9:00AM）、关灯时间（23：00PM），光照强度为 70%，每一次数据。点击摄像头视频生成按钮。点击观察程序开始（STAR）按钮，实斑马鱼自动成像系统自动记录相关数据。48 小时后，点击（stop）按钮并输的数据。

折线图,指纹图,折线图,有机溶剂

Rest total 黑夜 2.501 0.062Rest total 白天 5.484 0.039Rest bout 黑夜 2.969 0.196Rest bout 白天 14.371 0.000Rest bout length 黑夜 2.236 0.064Rest bout length 白天 1.875 0.114Rest lactency 开灯 0.638 0.672Rest lactency 关灯 3.689 0.061Activity total 黑夜 1.672 0.157Activity total 白天 3.038 0.017Waking activity 黑夜 1.195 0.324Waking activity 白天 3.512 0.0812.3.3 对有机溶剂影响的观察由于阳性对照组药物褪黑素需要溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，因此有必要确定DMSO 对斑马鱼幼鱼行为学的影响。因此我们做了溶剂的对比试验，DMSO 浓度设定为0.3%（参照文献），结果表明（图 2.2）指纹图谱中各个指标相对距离不超过±1，且折线图中没有明显差异。说明 DMSO 浓度在 0.3%以下对行为学实验结果没有明显影响。

折线图,指纹图,折线图,对边

广州中医药大学 2018 届硕士毕业论文图2.3对边沿效应的影响观察指纹图及折线图2.3.5 不同批幼鱼间的差异性分析由于行为学观察试验分批进行，每次试验所用的斑马鱼幼鱼不同，因此我们对不同批次的斑马鱼幼鱼的影响进行了行为学试验，将不同批次（即斑马鱼孵育的日期不是同一天）斑马鱼幼鱼的行为学表型进行对比，指纹图谱中除Rest total第二时段外，各个指标相对距离不超过±1，且折线图中没有明显差异（图2.4）。说明不同批次的幼鱼行为学差异不明显。图2.4不同批幼鱼间的差异性分析指纹图及折线图2.4 药物剂量的确定选择中药复方及药物组合的浓度对任何大规模的未知化合物筛选都是一个挑战。有效剂量可以在不同的化合物之间变化，但在大多数情况下，在多个浓度下进行筛选是不切实际的。决定我们的中药复方在 1-10 mg·mL-1范围内的是基于以下考虑因素。首先，我们在前期预实验中进行了多个浓度梯度的试验，具体药物浓度范围为 0.5-20mg·mL-。第二，这些中药组方在 15-20 mg·mL-1范围内呈明显毒性，大部分幼鱼（50%以上）多在 24 小时内出现死亡

【参考文献】