美洲大蠊多肽提取物制备工艺及抗肿瘤作用研究

发布时间：2020-07-12 19:56

【摘要】：目的:初步优选美洲大蠊多肽提取物的提取方法、多肽含量测定方法,深入研究美洲大蠊多肽提取物的体内抗肿瘤作用及体外对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响,旨在为美洲大蠊用于恶性肿瘤的治疗提供科学的实验依据,同时可为从天然药物中提取低毒高效的抗肿瘤活性部位提供新方向。方法:(1)制备工艺研究:采用超声法、渗滤法、加热回流法三种方法提取美洲大蠊多肽,同时采用福林酚法和双缩脲法两种方法测定美洲大蠊多肽提取物中的多肽含量,比较三种提取方法和两种测定方法的结果从而初步优选美洲大蠊多肽提取物的提取方法及多肽测定方法,。(2)体内抗肿瘤活性评价:建立小鼠肝癌H22和小鼠肉瘤S180的移植性肿瘤模型,检测美洲大蠊多肽提取物对肿瘤生长的影响。观察小鼠的活动情况及体重变化,评价美洲大蠊多肽提取物的体内抗肿瘤活性。(3)体外对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响:以A549(人肺腺癌细胞株)、SGC-7901(人胃癌细胞株)和Hela(人宫颈癌细胞株)为实验对象,经不同浓度的美洲大蠊多肽提取物作用48 h后,采用Cell Counting Kit(CCK-8)WST-8试剂盒测定对肿瘤细胞增殖的抑制作用。美洲大蠊多肽提取物对A549细胞凋亡的影响采用Hoechst 33258荧光染色及流式细胞仪AnnexinV/PI双染法进行检测。结果:(1)加热回流法提取的美洲大蠊多肽含量为34.18%和30.05%,超声法为25.63%和20.19%,渗滤法为28.74%和24.90%,加热回流法对美洲大蠊多肽的提取明显优于超声法和渗滤法。双缩脲法测定美洲大蠊多肽提取物中的多肽含量为25.63%、28.74%、34.18%,福林酚法为20.19%、24.90%、30.05%,通过两种方法的比较,双缩脲法对多肽测定存在高效性,明显优于福林酚法。(2)美洲大蠊多肽提取物25mg/kg、50mg/kg、100mg/kg(以多肽浓度计算)对H22实体瘤生长的抑瘤率分别为23.77%、35.83%、65.63%;对S180实体瘤生长的抑瘤率分别为20.16%、35.27%、57.36%,明显抑制S180和H22荷瘤小鼠肿瘤的生长。(3)美洲大蠊多肽提取物能明显抑制A549细胞的增殖,随浓度的增加,抑制作用增强,其IC50为54.65±1.73μg/ml,但对SCG-7901、Hela细胞作用不强,因此仅采用A549细胞进行后续研究。美洲大蠊多肽提取物作用于A549细胞48h后,Hoechst 33258荧光染色显示,不同浓度的美洲大蠊多肽提取物干预后可见核浓缩致密的强荧光团块及核碎裂等细胞凋亡形态学改变,且呈现出一定的量效关系,而阴性对照组成弥散均匀的淡蓝色弱荧光。AnnexinV/PI双染法检测显示,10、20、40、80、160μg/ml(以多肽浓度计算)的美洲大蠊多肽提取物均可诱导A549细胞凋亡,凋亡率分别为20.43±1.53%,34.86±2.01%,44.68±1.84%,53.19±1.53和65.57±2.14%,与阴性对照组比较,差异有显著性(P0.01)。结论:美洲大蠊多肽提取物最佳的提取方法是加热回流法,多肽含量测定以双缩脲法最优;美洲大蠊多肽提取物能明显抑制S180和H22荷瘤小鼠肿瘤的生长,具有较强的体内抗肿瘤活性;美洲大蠊多肽提取物能诱导A549细胞凋亡,抑制其增殖。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;R285
【图文】：

图 2 福林酚法测得牛血清白蛋白标准曲线ig.2 The standard curve of the reference substance of BSAof Lowry method 双缩脲法脲试液配制：

图 3 双缩脲法测得牛血清白蛋白标准曲线Fig.3 The standard curve of the reference substance of BSAof Biuret method3 比较美洲大蠊多肽提取物中多肽含量的两种测定方法将用超声法、加热回流法、渗滤法三种方法提取的的美洲大蠊

1. 丙氨酸 2. 甘氨酸 3-5. 美洲大蠊多肽提取物图4 美洲大蠊多肽提取物薄层色谱鉴别Fig 4 The TLC identification of polypeptide extract of Periplaneta americana实验结果显示：在美洲大蠊多肽提取物色谱中，美洲大蠊多肽提取物色谱中与对照品有相同的显色点，说明美洲大蠊多肽提取物是由甘氨酸、丙氨酸等多种氨基酸组合的混合型多肽。3.4.2 对美洲大蠊多肽提取物中多肽分子量的测定3.4.2.1 实验方法采用 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶）电泳法。配制好 12.5%的分离胶， 10%的夹层胶， 4%的浓缩胶。制板厚度1.00mm。将凝胶板放入电泳槽内，两玻璃板间加入阴极电泳缓冲液，电泳槽内加入阳极电泳缓冲液。待浓缩胶聚合后拔出样品梳，点样，依次加入对照品和供试品。接通电泳仪电源后，开始电压 60-80V

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本文编号：2752420