京尼平苷酸对人单核巨噬细胞THP-1胆固醇代谢调控机制研究

发布时间：2020-07-12 23:20

【摘要】：目的:动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是常见的心血管系统疾病,随着人们生活水平的提高,AS的发病率有逐年上升趋势,严重危害人类健康。AS的病因复杂,机制尚不完全明确,现代医学认为,AS病变基础为脂质代谢障碍,血管内膜受损,脂质和复合糖类积聚、出血及血栓形成,进而纤维组织增生及钙质沉着,形成动脉粥样硬化斑块,并有动脉中层的逐渐蜕变和钙化,导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄,最终导致各种心血管事件的发生。临床上治疗AS药物较多,但作用效果不理想。车前子属于利水渗湿药,有清热利尿、渗湿通淋、清肝明目、止咳驱痰等功效,现代医学研究发现,车前子有抗动脉粥样硬化、抗炎、降血脂等作用~([176]),但抗AS的有效成分及作用机制不清楚。本文利用计算机分子对接技术筛选了车前子中调控巨噬细胞胆固醇代谢的有效化合物,并选取车前子中一种化合物京尼平苷酸(Geniposidic acid,GPA)作为研究对象;全面考察了京尼平苷酸对人单核巨噬细胞源泡沫细胞THP-1胆固醇代谢调控相关蛋白的影响;进一步探讨了京尼平苷酸抗动脉粥样硬化可能机制,为其进一步开发提供基础理论数据。方法:1.车前子的成分与巨噬细胞胆固醇调控相关蛋白虚拟分子对接研究利用计算机虚拟筛选方法建模,以中药车前子的55个化学成分为对象,选取3个与巨噬细胞胆固醇代谢调控密切相关的靶蛋白ATP结合盒转运体A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、清道夫受体CD36(Scavenger receptor CD36,CD36),血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)作为受体,采用SYBYL分子对接方法,以Total Score结合打分为标准,筛选得分最高的化合物,同时观察其MOLCAD显示的与相关蛋白表面疏水性和氢键供体与受体区域,利用Discovery Studio 2016软件进行分析,预测其结合模式及亲和力。2.京尼平苷酸对氧化性低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)诱导的人单核巨噬细胞源泡沫细胞THP-1胆固醇代谢调控机制研究用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养人单核细胞THP-1,160nM丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导人单核细胞THP-1分化为巨噬细胞。从车前子成分中选择1个Total Score打分较高化合物(京尼平苷酸)作为研究对象。第一批分组:设oxLDL(50mg/L)组、oxLDL+GPA(200mg/L)组、oxLDL+GPA(100mg/L)、oxLDL+GPA(50mg/L)组。第二批分组:设空白对照(CONTROL)组,oxLDL(50mg/L)组,GPA(200mg/L)+oxLDL组,GPA(200mg/L)+oxLDL+Compund C(10μM)组。培养24h后,油红O染色观察泡沫细胞内脂滴变化;采用RT-PCR方法检测ABCA1、ABCG1、CD36、LOX-1、SR-A1、SR-B1 mRNA的转录水平;使用蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)法检测ABCG1、ABCA1、CD36蛋白表达水平。3.京尼平苷酸对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的人单核巨噬细胞THP-1炎性因子分泌的影响用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养人单核细胞THP-1,160nM诱导人单核细胞THP-1分化为巨噬细胞。设空白对照(CONTROL)组,LPS(500ng/mL)组,GPA(200mg/L)+LPS组,GPA(200mg/L)+LPS+BAY11-7082(10mM)组。培养24h后,油红O染色观察巨噬细胞内脂滴变化;提取核酸RT-PCR方法检测ABCA1、ABCG1、CD36、LOX-1、SR-A1、SR-B1、TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α、CD206、IL-10mRNA的转录水平;提取蛋白WB法检测ABCG1、ABCA1、CD36蛋白表达水平;收集培养上清液,通过ELISA方法检测各组上清液中TNF-α、IL6浓度。设空白对照(CONTROL)组,LPS(500ng/mL)组,GPA(200mg/L)+LPS组。使用DCFH-DA探针37℃下作用30min,流式细胞术检测GPA对人单核巨噬细胞THP-1活性氧的影响,倒置荧光显微镜观察细胞内活性氧水平变化。4.京尼平苷酸对PPARγ信号通路介导胆固醇调控机制的研究用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养人单核细胞THP-1,160nM PMA诱导人单核细胞THP-1分化为巨噬细胞。设空白对照(CONTROL)组,oxLDL(50mg/L)组、oxLDL+GPA(200mg/L)组、oxLDL+GPA(200mg/L)+GW9662(PPARγ抑制剂)、oxLDL+GPA(200mg/L)+BRL(PPARγ激活剂),处理24小时后,提取核酸RT-PCR方法检测PPARγ、LXR-α、ABCA1、ABCG1、CD36、LOX-1 mRNA的转录水平。结果:1.通过计算机虚拟分子对接技术,筛选并选取了与ABCA1蛋白结合打分较高的京尼平苷酸作为研究对象。通过SYBYL分子对接的方法,观察到车前子中有3个化合物与调节泡沫细胞胆固醇代谢中ABCA1蛋白结合Total Score打分较高,同时3个化合物与ABCA1蛋白结合,可产生多种分子间作用力,使小分子牢固地结合在活性位点。从车前子成分中选择1个Total Score打分较高化合物(京尼平苷酸)作为研究对象,根据供货方提供的数据,本实验使用的GPA为纯度99.3221%单一化合物。CCK8细胞增殖抑制率实验结果显示,京尼平苷酸各剂量组(200mg/L、100mg/L、50mg/L)对人单核巨噬细胞源泡沫细胞THP-1增殖抑制率未见明显影响。2.oxLDL诱导人单核巨噬细胞THP-1建立泡沫细胞模型,GPA可通过提升ABCA1、ABCG1基因和蛋白表达水平,降低LOX-1、CD36基因或蛋白表达水平,来降低泡沫细胞内胆固醇的含量;以上作用效果可被AMPK抑制剂(Compund C)抑制。GPA可剂量依赖性影响ABCA1、ABCG1、LOX-1、CD36基因或蛋白表达水平。oxLDL(50mg/L)作用人单核巨噬细胞THP-1经GPA、GPA+Compund C处理24小时后,oxLDL(50mg/L)组油红O染色见胞内充满大量红色脂滴,呈泡沫样改变,经异丙醇萃取胞内胆固醇后,与空白组有明显差异,即成功建立了泡沫细胞模型;RT-PCR结果说明,人单核巨噬细胞源泡沫细胞THP-1中ABCA1、ABCG1 mRNA表达降低,LOX-1、CD36表达升高,差异有统计学意义(P0.05或P0.01);WB结果显示,oxLDL组的ABCA1、ABCG1蛋白表达水平显著降低,而CD36的蛋白表达水平显著升高。油红O染色结果显示,京尼平苷酸(200mg/L、100mg/L)能显著降低人单核巨噬细胞源泡沫细胞THP-1内脂滴的含量;RT-PCR结果说明,京尼平苷酸(200mg/L、100mg/L)能提高ABCA1、ABCG1 mRNA表达水平,降低LOX-1、CD36 mRNA表达水平,差异有统计学意义(P0.05或P0.01),对SR-A1,SR-B1 mRNA表达水平未见显著影响(P0.05);WB结果显示,京尼平苷酸(200mg/L)组能提高ABCA1、ABCG1蛋白的表达水平,能降低CD36蛋白表达水平。AMPK抑制剂(Compund C)能抑制GPA(200mg/L)对ABCA1、ABCG1mRNA表达水平提高及对CD36、LOX-1mRNA表达水平降低的作用,差异有统计学意义(P0.05);AMPK抑制剂(Compund C)能显著降低ABCG1蛋白的表达水平,能显著提高CD36蛋白的表达水平。京尼平苷酸200、100、50mg/L剂量组作用泡沫细胞24小时后,与oxLDL组相比,京尼平苷酸200、100mg/L剂量组能提高ABCA1、ABCG1 mRNA的表达水平(P0.05),降低CD36、LOX-1的表达水平(P0.05),对SR-B1、SR-A1表达水平未见显著性变化(P0.05);与oxLDL组相比,京尼平苷酸200、100mg/L能提高ABCA1、ABCG1的蛋白表达水平,降低CD36的表达水平。3.LPS刺激了人单核巨噬细胞THP-1产生炎性反应,GPA能通过改善胞内氧化应激,降低NF-κB基因表达水平,来降低炎性因子IL-6、TNF-α的基因表达水平和细胞上清液中TNF-α、IL-6的浓度。TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α、CD206、IL-10 RT-PCR检测结果:LPS诱导的人单核巨噬细胞THP-1经GPA、GPA+BAY11-7082处理24小时后,提取核酸RT-PCR方法检测mRNA表达水平。与CONTROL组相比,LPS组的TLR4、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表达水平显著升高(P0.05),而CD206、IL-10的表达水平显著降低(P0.01);与LPS组相比,GPA(200mg/L)组能显著降低IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表达水平,显著提高CD206、IL-10的表达水平,差异有统计学意义(P0.05或P0.01),对TLR4未见明显影响(P0.05)。与京尼平苷酸(200mg/L)组相比,NF-κB抑制剂(BAY11-7082)组能进一步降低IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表达水平,进一步提高CD206的表达水平,差异有统计学意义(P0.05);对IL-10的表达水平有进一步提高的趋势(P0.05),对TLR4未见明显影响(P0.05)。LPS刺激人单核巨噬细胞THP-1分泌TNF-α、IL-6,通过ELISA方法检测各组细胞上清液中TNF-α、IL-6的浓度。ELISA结果显示,GPA能抑制人单核巨噬细胞THP-1分泌TNF-α、IL-6,NF-κB抑制剂(BAY11-7082)组能进一步降低细胞上清液中IL-6、TNF-α的浓度。人单核巨噬细胞THP-1经LPS处理后,细胞内ROS水平较对照组明显增强,加入GPA(200mg/L)24小时后,LPS诱导增加的细胞内ROS水平被抑制。油红O染色经异丙醇萃取胞内胆固醇后,LPS组比空白组有增加胆固醇趋势;与LPS组比,京尼平苷酸(200mg/L)组有降低胞内胆固醇含量的趋势。ABCA1、ABCG1、CD36、LOX-1、SR-A1、SR-B1 RT-PCR检测结果:与CONTROL组相比,LPS组的ABCA1、ABCG1 mRNA的表达水平有降低趋势,而CD36、LOX-1的表达水平有升高趋势,差异无统计学意义(P0.05),SR-B1、SR-A1表达水平未见显著性变化(P0.05);与oxLDL组相比,京尼平苷酸(200mg/L)组有提高ABCA1、ABCG1 mRNA的表达水平的趋势,具有降低CD36、LOX-1 mRNA的表达水平的趋势,差异无统计学意义(P0.05),对SR-B1、SR-A1表达水平未见显著性变化(P0.05)。与京尼平苷酸(200mg/L)组相比,NF-κB抑制剂(BAY11-7082)组对ABCA1、ABCG1、CD36、SR-B1、SR-A1未见影响(P0.05)。4.oxLDL诱导人单核巨噬细胞THP-1建立泡沫细胞模型,GPA能提高PPARγ、LXR-α的基因表达水平,从而提高了ABCA1、ABCG1的基因表达水平,降低了CD36、LOX-1的基因表达水平。oxLDL诱导的人单核巨噬细胞源泡沫细胞THP-1经GPA、GPA+GW9662、GPA+BRL处理24小时后,提取核酸RT-PCR方法检测mRNA表达水平。PPARγ、LXR-αRT-PCR检测结果:与CONTROL组相比,oxLDL组的PPARγ、LXR-αmRNA的表达水平显著降低,差异有统计学意义(P0.01);与oxLDL组相比,京尼平苷酸(200mg/L)组能显著提高PPARγ、LXR-αmRNA的表达水平,差异有统计学意义(P0.01);与京尼平苷酸(200mg/L)组相比,GW9662(PPARγ抑制剂)组能抑制京尼平苷酸提高PPARγ、LXR-αmRNA的表达水平的作用,差异有统计学意义(P0.01);BRL(PPARγ激活剂)组对PPARγ、LXR-αmRNA的表达水平未见显著变化,无统计学差异(P0.05)。ABCA1、ABCG1、CD36、LOX-1检测结果:与oxLDL组相比,GPA(200mg/L)组的ABCA1、ABCG1 mRNA显著升高,CD36、LOX-1 mRNA表达水平显著降低,差异有统计学意义(P0.05或P0.01);与GPA(200mg/L)组相比,GPA+GW9662组的ABCA1、ABCG1 mRNA的表达水平显著降低,CD36、LOX-1mRNA表达水平显著升高,差异有统计学意义(P0.05或P0.01);与GPA(200mg/L)组相比,GPA(200mg/L)+BRL组的ABCA1、ABCG1 mRNA的表达水平显著升高(P0.05),CD36、LOX-1 mRNA表达水平未见显著变化(P0.05)。结论:利用计算机虚拟分子对接技术对车前子成分进行化合物筛选,把其中与受体ABCA1对接打分较高的化合物京尼平苷酸作为研究对象。通过体外细胞实验研究发现,京尼平苷酸能够影响人单核巨噬细胞源泡沫细胞THP-1胆固醇代谢,与APMK、PPARγ介导的胆固醇调控信号通路有关;同时,京尼平苷酸能够抑制人单核巨噬细胞THP-1炎性因子分泌,是通过对NF-κB介导的炎性因子信号通路起作用。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285
【图文】：

巨噬细胞,调控机制

胞在 AS 发生发展的各个阶段起重要作用[19]。炎症内皮细胞释核细胞依附在异常损伤的动脉内膜并侵入内膜。由于血流变化脂质积累，血管部位损伤或动脉粥样化异常，从而引起单核胞趋化。在内皮下层，单核细胞分化为巨噬细胞，在内环境中的刺激下，巨噬细胞可分化为促炎症/抗炎症两种表型，最终0]。泡沫细胞的形成发生在动脉粥样硬化初始阶段，是动脉粥22]。氧化型低密度脂蛋白的摄入增加或胆固醇外流减少导致巨醇脂质的聚集和泡沫细胞的形成[23]。在巨噬细胞中，oxLDL夫受体完成的（图 1）[24]。主要包括：CD36、SR-A1、LOX胆固醇酰基转移酶-1（ACAT1）和中性胆固醇酯水解酶（nce形成[25]。ABCA1 和 ABCG1 和 SR-B1 促进了巨噬细胞胆固醇了解动脉粥样硬化发展中调节胆固醇代谢分子机制研究，有助脉粥样硬化的关系，以下阐述了巨噬细胞中负责胆固醇调控的胆固醇逆转运的关键机制，特别是在巨噬细胞中的机制。

结构图,化合物,结构图,苯乙醇苷

广州中医药大学 2018 届博士学位论文MOLO00086-001 N/A 387-80-4 11.4517MOLO07815-001 车前草苷 D 147331-98-4 10.4517MOLO06682-001 木通苯乙醇苷 A 84744-28-5 10.287MOLOO0158-000 木通苯乙醇苷 B 105471-98-5 9.2624利用 SYBYL 分子对接，得出车前子的 55 个小分子配体与 3 个靶标蛋分子对接结合打分整体情况（见表 2），得分最高的为以下小分子：西托异类叶升麻苷、京尼平苷酸和车前草苷 D，均有文献报道其为车前子主要成打分具体情况及各小分子的结构（见表 2，图 2）。对打分得分最高的化合行 MOLCAD 展示了靶蛋白的表面疏水性和氢键供体与受体区域，以及靶蛋白合物的结合作用模式图（图 3-5）。

模式图,模式图,结合作用,糖苷

究其三维结构与 ABCA1 靶蛋白的相互作用，并以 MOLCAD 展示了与靶蛋白的表面疏水性和氢键供体与受体区域。观察到 ABCA1 的活性口袋中，存在多处氢键受体和氢键供体，借助 Discovery Studio 2016 软件对其进行相互作用的分析，发现异类叶升麻苷与靶蛋白的 SER264、LEU316、GLU267、ARG305、MET298位点可有效的结合产生氢键，与 PHE335、LEU331、PHE326、THR258、PHE257、ILE295、TRP443、VAL263、LEU260、PHE315、GLU301 位点有范德华引力的相互作用。（三）京尼平苷酸与 ABCA1(5XJY）分子对接结果（见图 5）京尼平苷酸与 ABCA1 蛋白分子对接 Total Score 结合打分为 11.6992。研究其三维结构与 ABCA1 靶蛋白的相互作用，并以 MOLCAD 展示了与靶蛋白的表面疏水性和氢键供体与受体区域。观察到 ABCA1 的活性口袋中，存在多处氢键受体和氢键供体，借助 Discovery Studio 2016 软件对其进行相互作用的分析，发现京尼平苷酸与靶蛋白的 LEU260、MET298、GLU301、SER264、ARG305、GLU267 位点可有效的结合产生氢键，与 VAL263、LEU316、LEU299、ILE295、PHE335、ILE339、LEU331、THR302、ALA261 位点有范德华引力的相互作用。

【参考文献】