草乌甲素对过敏性哮喘小鼠肺部炎症的治疗与机理初步探讨

发布时间：2020-07-12 23:54

【摘要】：目的:探讨草乌甲素对过敏性哮喘小鼠模型肺部炎症的治疗效果及其可能的机理;分析草乌甲素对LPS激发的RAW264.7细胞炎症模型的抗炎效果及其潜在的分子机制。方法:60只SPF级Balb/c雌鼠(20±2g),随机分为6组:阴性对照组(NC组);哮喘组(Asthma组);草乌甲素低剂量治疗组(BLA-L组:0.16 mg/kg);草乌甲素中剂量治疗组(BLA-M组:0.32 mg/kg);草乌甲素高剂量治疗组(BLA-H组:0.48 mg/kg);地塞米松阳性治疗组(Dex组:1 mg/kg)。哮喘组及BLA各剂量组分别于第0、7及14天进行OVA 10μg与2%氢氧化铝混悬液0.2m L腹腔注射。从第22天起,各组小鼠雾化吸入5%OVA致敏液激发,每天一次,每次30分钟,持续雾化7天。阴性对照组用PBS代替致敏液,其余条件与用药组相同。每次雾化前30分钟,BLA低剂量组、中剂量组以及高剂量组小鼠分别给予BLA0.16mg/kg、0.32mg/kg、0.48mg/kg,腹腔注射0.2m L,阴性对照组及哮喘组则用等量的PBS代替。第28天处死小鼠。(1)收集血清,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中总Ig E、总Ig G水平;(2)收集支气管肺泡灌洗液(BALF),ELISA法检测细胞因子IL-4、IL-10、TNF-α与MCP-1水平;同时对BALF中的白细胞(包括白细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞)进行细胞分类计数;(3)取肺组织并进行常规石蜡包埋,行HE染色观察组织学改变;(4)Western Blotting检测肺组织中NF-κB信号通路中关键蛋白NF-κB1与PKC-δ的表达水平。小心从液氮罐中取出冻存的RAW264.7,细胞复苏后添加10%的胎牛血清、1%青霉素与链霉素的双抗的DMEM高糖完全培养基在37℃、5%的CO2培养箱内培养,细胞经传代后冻存留种用于后续实验。细胞种板后设置如下组别:Control组,单用草乌甲素组(60μg/m L),LPS组(100μg/m L),LPS+BLA(10μg/m L),LPS+BLA(30μg/m L),LPS+BLA(60μg/m L),收集细胞后进行如下检测。(5)培养巨噬细胞RAW264.7,CCK-8确定药物安全范围;(6)ELISA法检测细胞上清液炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的水平;(7)WB检测NF-κB信号通路中关键蛋白同(4)。结果:小鼠血清中总Ig E、总Ig G的水平的结果表明,与哮喘组(64.16±5.91)ng/m L相比,草乌甲素低中高治疗组(44.38±3.56)、(32.48±2.62)、(24.54±2.11)ng/m L、Dex组(25.48±1.30)ng/m L总Ig E水平明显降低(P0.01),其中用药组中高剂量组效果最为显著;与哮喘组(34.38±2.08)ng/m L相比,BLA-L组(25.41±1.19)ng/m L、BLA-M组(18.66±0.78)ng/m L、BLA-H组(17.70±0.63)ng/m L的总Ig G含量显著降低(P0.01);而Dex组(15.72±0.46)ng/m L的Ig G含量最低。由此我们认为,草乌甲素治疗可显著降低血清总Ig E和总Ig G水平,并呈现剂量依赖性。肺泡灌洗液中细胞因子IL-4、IL-10、TNF-α与MCP-1的水平结果表明:与哮喘组(339.47±2.52)pg/m L相比,草乌甲素低中、高处理组BALF(298.82±3.86)、(277.89±7.53)、(277.81±5.98)pg/m L中IL-4的含量降低(P0.01)。与哮喘组(454.25±23.16)pg/m L相比,草乌甲素低中、高处理组(376.24±27.12)、(260.10±17.59)、(245.50±17.92)pg/m L中TNF-α含量逐步降低(P0.01)且BLA-H组效果最佳。草乌甲素中、低、高处理组的细胞因子IL-10均大于哮喘组(26.20±1.35)pg/m L(P0.01),Dex组(99.00±4.35)与BLA-H组(97.53±8.60)pg/m L无差异。NC组、AS组、BLA-L组、BLA-M组、BLA-H组、Dex组的细胞因子MCP-1水平分别为(336.15±37.81)、(670.64±52.74)、(630.68±37.66)、(410.39±10.97)、(518.13±25.20)、(360.97±21.66)pg/m L。与哮喘组相比,BLA-L组MCP-1含量下降(P0.05),而BLA-M组与BLA-H组含量显著减少(P0.01)。不同剂量草乌甲素能有效抑制哮喘小鼠肺泡灌洗液中炎性因子IL-4、TNF-α与MCP-1的含量。为了了解草乌甲素对肺泡灌洗液中细胞数量的影响,我们对其进行分类计数。结果草乌甲素处理组的Eos数量明显低于哮喘组(5.58±0.22)×104/m L(P0.01);与BLA-H组(1.46±0.16)×104/m L相比,Dex组治疗(1.29±0.20)×104/m L的效果更佳。与哮喘组(0.47±0.05)相比,BLA-M组(0.35±0.04)、BLA-H组(0.30±0.03)、Dex组(0.39±0.04)×104/m L淋巴细胞数量降低(P0.05),BLA-L组(0.52±0.07)×104/m L对淋巴细胞的抑制作用不显著(P0.05)。草乌甲素处理组巨噬细胞数显著低于哮喘组(4.85±0.34)(P0.01)。与BLA-L组(2.36±0.36)相比,BLA-M组(1.75±0.20)、BLA-H组(1.13±0.19)及Dex组(1.25±0.26)×104/m L巨噬细胞减少(P0.01)。BLA-H组与Dex组之间差异无统计学意义。肺组织HE染色显示草乌甲素治疗后能显著减轻肺部炎性细胞浸润,且结构完整性明显改善,其中BLA-H组效果最明显。WB检测结果表明BLA处理可引起肺组织中NF-κB信号通路NF-κB1与PKC-δ表达下调。CCK-8实验表明草乌甲素在小于60μg/m L浓度时对RAW264.7细胞活力没有显著影响,因此将10、30和60μg/m L浓度分别作为后续实验的低、中、高剂量组。草乌甲素能有效抑制LPS诱导RAW264.7细胞炎症因子及炎症介质IL-6、TNF-α和MCP-1的含量,IL-1β的表达没有意义。草乌甲素能有效抑制LPS诱导的RAW264.7细胞转录因子NF-κB信号通路中NF-κB1和PKC-δ入核。结论:1.草乌甲素能够减轻过敏性哮喘小鼠的肺部炎症状态;可能是通过抑制PKC-δ/NF-κB信号实现的。2.草乌甲素抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎性因子IL-6,TNF-α和MCP-1的释放。3.草乌甲素通过抑制LPS诱导的NF-κB信号通路的活化从而发挥抗炎作用。
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

图 1.草乌甲素分子结构图拟通过以下研究探讨 BLA 在过敏性哮喘小鼠中的抗炎作用：过卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）致敏 Balb/c 雌鼠，建立

动物模型复制示意图

图 3.草乌甲素对血清总 IgE、总 IgG 的影响 组相比，P < 0.01；b，与 BLA-L 组相比，P < 0.01；c，与 BLA-M 相相比，P < 0.01；b，与 BLA-L 组相比，P < 0.01；c，与 BLA-M 组相LA-H 组相比，P < 0.05。

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本文编号：2752656