芍药苷抗骨质疏松效应及其GPR30相关机制探讨

发布时间：2020-07-13 07:41

【摘要】：骨质疏松症(Osteoporosis,OP)是严重威胁中老年健康的常见病和多发病之一,其特征在于骨量、强度和微结构的系统性损害。骨代谢平衡是维持骨量的重要前提,而骨代谢的稳定主要是由破骨细胞(osteoclasts,OCs)主导的骨吸收和成骨细胞(osteoblasts,OBs)主导的骨形成之间的动态平衡所维持,当骨吸收率超过骨形成率时骨质疏松症发生。当归芍药散(Danggui Shaoyao San,DSS)是治疗妇科疾病的常用复方之一,实验室前期研究证实DSS对去卵巢(OVX)诱导的OP大鼠具有显著的骨保护作用,但其干预OP的作用是否与抑制OC的分化有关目前尚不明确。白芍作为DSS中的君药,被广泛用于中医治疗OP的常用处方中。芍药苷(Paeoniflorin,PF)是白芍的主要活性成分,己被广泛用于治疗各种自身免疫疾病,如类风湿性关节炎和强直性脊柱炎等。但PF是否能够抑制OCs分化及抗OP作用,目前尚缺乏更多的研究。课题组前期研究发现DSS能够显著促进新型膜雌激素受体G蛋白偶联受体30(G protein-coupled receptor 30,GPR30)的蛋白表达,同时PF能够与存在于细胞膜上的雌激素受体(ER)结合。而GPR30被发现参与了OCs的分化。因此本实验主要研究了PF对OC分化的干预效应,以及PF干预OCs分化与膜雌激素受体GPR30的相关性,另外初探了PF对OB前体细胞凋亡的效应。在文献研究和前期实验基础上,本课题主要围绕以下几点开展研究:1.DSS和PF对OCs分化的干预效应建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW 264.7细胞OCs分化模型,分组如下:Control组、LPS组、LPS+DSS组、LPS+PF组。培养4天后,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和TRAP活性检测显示DSS(10-7 g/L,10-6 g/L)和PF(0.1 μM,1 μM,10 μM,25μM)均能显著抑制TRAP 阳性细胞的产生和TRAP活性;另外,WB检测显示PF对OCs分化标志蛋白TRAP、CTSK和NFATc1的表达具有显著抑制作用,且呈剂量依赖性。建立了核因子受体激活剂(NF)-κB 配体(Receptor activator of nuclear factor-κ B ligand,RANKL)诱导的OCs分化模型,再次验证PF抑制OCs分化的作用。分组如下:Control组、RANKL组、RANKL+PF组。TRAP染色和TRAP活性检测同样显示PF显著减少了TRAP阳性细胞数目、抑制了TRAP活性。RT-PCR结果显示PF对OCs分化标志基因如CTSK、NFATc1、c-Fos和Dc-stamp的mRNA水平具有显著抑制作用。2.PF对骨吸收效应的干预作用为进一步评价PF对骨吸收的影响,RAW 264.7细胞被接种到玻璃片或者骨磨片上,在LPS或RANKL存在条件下与不同浓度的PF共培养6 d。FITC标记鬼笔环肽染色显示PF可显著抑制LPS和RNAKL诱导的肌动蛋白环(Fibrous actin ring,F-actin ring)形成;甲苯胺蓝染色显示PF可显著减少骨磨片上骨吸收窝陷数目。3.PF对OCs分化中活性氧水平及MAPKs和NF-κB信号通路的影响活性氧(reactive oxygen species,ROS)被认为是OCs分化过程的第二信使,可激活OCs分化基本信号通路如MAPK(p38 MAPK,ERK和JNK)和NF-κB等信号传导途径,从而促进OCs的分化。RAW 264.7细胞在LPS存在条件下与不同浓度PF共培养4 d,用流式细胞术观察ROS水平,结果显示PF能显著抑制LPS诱导升高的ROS水平,尤其是10 μM PF。WB结果显示,与刺激相同时间的LPS组比较,PF组可明显降低P-p38/p38和P-p65/p65的蛋白比值。4.PF抑制OCs分化与GPR30的相关性文献研究发现GPR30参与OCs分化过程。前述结果表明,PF对OCs分化具有显著的抑制作用,为了进一步探究PF抑制OCs分化与GPR30的相关机制,我们进行以下实验:(1)PF对LPS诱导OCs分化中GPR30蛋白表达的影响。WB结果显示PF处理后以浓度依赖性方式促进GPR30的表达。(2)加入GPR30特异性拮抗剂G15,观察PF对LPS诱导ROS水平以及OCs分化的干预效应。结果显示,PF降低ROS水平的作用被G15拮抗了;PF抑制LPS诱导增加的TRAP 阳性细胞数目、增强的TRAP活性以及升高的OCs标志基因mRNA水平的能力均被G15逆转。(3)对RAW264.7细胞进行GPR30基因沉默,观察PF对LPS诱导OCs分化的干预效应。RT-PCR结果显示GPR30沉默后PF抑制OCs标志基因表达的作用消失。5.PF对泼尼松龙诱导的斑马鱼骨质疏松症的干预效应(1)建立泼尼松龙诱导的斑马鱼幼鱼OP模型。选取受精3天(3 dpf)的健康斑马鱼,分组:Control组、Model组(25 μM泼尼松龙)、PF组(1 μM 和10 μM)。除Control组,各组在给药前预先给予泼尼松龙造模2 d,随后连续给药4 d。钙黄绿素染色显示PF对泼尼松龙诱导的斑马鱼幼鱼第一椎骨的形成具有显著促进作用。RT-PCR结果显示PF可促进OBs标志基因的表达,同时抑制OCs标志基因的表达。(2)建立泼尼松龙诱导的斑马鱼成鱼尾鳍骨再生抑制模型。斑马鱼剪尾后,分组如下:Control组、Model组(25μM泼尼松龙)、Model+PF组(1μM 和10 μM),连续给药14天。于第4、7、11和14天采集图片,观察斑马鱼尾鳍骨再生情况,结果显示PF可显著促进斑马鱼成鱼的尾鳍骨再生。尾鳍样本RT-PCR检测结果显示PF可抑制OCs标志基因、促进OBs标志基因的表达。6.PF对前成骨细胞凋亡的干预作用上述研究提示PF可促进OBs介导的骨形成,而OBs是由前OBs分化而来,因此抑制前OBs凋亡有助于促进骨形成。建立地塞米松(Dexamethasone,DEX)诱导的MC3T3-E1细胞凋亡模型,观察PF抗前OBs凋亡作用。MTT显示PF可缓解DEX对MC3T3-E1细胞活力的抑制作用,流式细胞术显示PF可显著降低细胞凋亡率。免疫荧光显示PF可显著抑制Fox03a的入核,WB显示PF显著促进了Bcl-2的蛋白表达。结论:(1)DSS能够抑制OCs分化。PF对OCs分化和骨吸收功能均具有显著抑制作用,提示PF可能是DSS发挥抗OP作用的有效成分。(2)GPR30拮抗剂可逆转PF对ROS水平的抑制作用,拮抗PF抑制LPS诱导的OCs分化的作用;GPR30沉默后,PF抑制OCs分化的作用被消除。以上提示PF可能通过GPR30/ROS依赖的途径抑制OCs分化。(3)PF促进OP斑马鱼幼鱼第一椎骨生成和成鱼尾鳍骨再生,同时抑制了OCs标志基因的表达,促进了OBs标志基因的表达。以上提示PF具有抗OP作用,并且是通过促进骨形成和抑制骨吸收实现的。(4)PF可通过抑制Fox03a的核易位发挥抗前成骨细胞凋亡作用。综上所述,PF可通过促进GPR30蛋白表达抑制OCs分化,通过抑制Fox03a的核易位抗前OBs凋亡,从而抑制骨吸收促进骨形成,维持骨稳态,发挥OP治疗作用。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285
【图文】：

研究假说:芍药普干预破骨细胞分化可能与GPR30密切相关

．逦ｔ逦．逦，逦．逡逑，，－．邋■邋＊逡逑图１－１－２邋ＬＰＳ对ＴＲＡＰ阳性细胞生成的影响。（Ｘ２００，标尺＝１００邋ｐｍ）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＬＰＳ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＴＲＡＰ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｅｌｌｓ．邋（ｘ２００，邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒｓ：邋１００逡逑哗）逡逑

１－１邋ＲＡＷ邋２６４．７细胞形态学观察。（ｘ４００，标尺：１０ｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＲＡＷ邋２６４．７邋ｃｅｌｌｓ．邋（ｘ４００，邋Ｓｃａｌ激ＲＡＷ２６４．７细胞４天，ＴＲＡＰ染色结果表明，Ｔ比，ＬＰＳ各组ＴＲＡＰ阳性细胞数目均显著增多，但性细胞数目无显著差异，且与１００邋ｎｇ／ｍＬ以下ＬＰ势（图１－１－２）。原因可能是大于１００邋ｎｇ／ｍＬＬＰＳ对前体数目减少，最终导致ＯＣ数目降低。逡逑１０邋ｎｇ／ｍＬ邋ＬＰＳ逦５０＇逦，，逦？，逦＾逦＾邋－ｔ邋％逦ｉ逡逑．、逦■．逡逑＊邋、邋．邋．

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