脾阴虚大鼠肠黏膜屏障变化与滋补脾阴方药干预作用研究

发布时间：2020-07-13 17:30

【摘要】：目的:探讨脾阴虚状态下大鼠肠黏膜屏障的变化情况,并观察滋补脾阴方药干预的作用。方法:适应性喂养3天后,将SPF级雄性Wistar大鼠根据随机分组原则,分为正常组6只,模型组14只。采用经典复合因素,即以饮食不节和劳倦过度结合耗伤阴液法建立脾阴虚大鼠模型。造模时间共38天,分为3个阶段:①脾气虚阶段(第1-14天):饱食1日+禁食2日(3日为一循环)。每日游泳至力竭。②脾阴虚阶段(第15-24天):排除不符合脾气虚标准大鼠1只及死亡大鼠1只。将剩余12只大鼠全部纳入脾阴虚阶段,每日灌服伤阴药(1 mL/1000g/只)。③滋补脾阴方药给药阶段(第25-38天):将模型组分为脾阴虚组(6只)和滋补脾阴方药组(6只)。滋补脾阴方药组每日予以滋补脾阴方药干预,按照1 mL/100 g进行胃饲。正常组与脾阴虚组予等体积生理盐水灌胃。并于实验第7天、第14天、第21天、第28天以及第35天收集大鼠粪便,通过16S rRNA V3-V4区测序分析大鼠肠道微生物群落的多样性及门、属水平上差异菌群的丰度,评价肠黏膜生物屏障变化。应用Western blotting和qPCR技术检测肠道紧密连接蛋白表达以评价肠黏膜机械屏障变化;ELISA法测定相关免疫细胞因子水平以反映肠黏膜免疫屏障的改变。结果:一、脾阴虚大鼠肠黏膜生物屏障变化及滋补脾阴方药干预作用研究1.Alpha多样性结果显示:脾气虚阶段末,脾气虚组相比于正常组Simpson指数与Shannon指数增加;脾阴虚阶段末,脾阴虚组大鼠肠道菌群Simpson和Shannon指数变化不显;滋补脾阴方药给药阶段末,即第5周,脾阴虚组相比于正常组Simpson与Shannon指数均下降,滋补脾阴方药组Simpson与Shannon指数较脾阴虚组相比增加,且滋补脾阴方药组与正常组之间无明显差异。2.基于门水平上差异菌群分析结果显示,各组大鼠肠道菌群中共检测到8种主要细菌,厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门是脾阴虚大鼠粪便细菌的主要组成部分。其中,厚壁菌门是最丰富的菌门。比较第1-5周各组大鼠肠道菌群中优势菌门变化结果显示,各阶段变化显著。脾气虚阶段第1周,相比于正常组,脾气虚组厚壁菌门与F/B比例明显增加,拟杆菌门与放线菌门减少。至第2周,脾气虚组与正常组相比,厚壁菌门和F/B 比例降低,放线菌门明显增加,拟杆菌门有上升趋势,但拟杆菌门变化无统计学意义。在脾阴虚阶段,脾阴虚组大鼠肠道菌群中厚壁菌门、F/B与放线菌门比例均有上升趋势,拟杆菌门比例有降低趋势,但差异3.无统计学意义。至滋补脾阴方药干预阶段末(第5周),与正常组相比,脾阴虚组厚壁菌门与F/B水平增加,拟杆菌门和放线菌门下降;相比于脾阴虚组,滋补脾阴方药组厚壁菌门与F/B明显下降,拟杆菌门和放线菌门比例均升高。4.基于属水平上差异菌群分析结果显示,第1-5周脾阴虚大鼠肠道菌群中乳杆菌属(Lactobacillus)整体水平下降,至第4周降至最低水平,且与前3周均具有显著差异,第5周该菌水平相比于第1-2周下降;梭菌属(Clostridium)相对丰度在第1-5周呈逐渐上升趋势;脾阴虚阶段,颤螺菌属(Oscillospira)水平相比于脾气虚阶段降低,第4-5周呈增加趋势。Metastats分析结果显示,第1-5周各组大鼠肠道差异菌群处于不断变化中,主要包括乳杆菌属、颤螺菌属、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、粘放线菌属(Adlercreutzia)、拟杆菌属(Bacteroides)、Anaerostipes 属、罗氏菌属(Rothia)、Aggregatibacter 属、普雷沃菌属(Prevotella)、别样棒菌属(Allobaculum)、丁酸弧菌属(Butyricimonas)、Cornebacterium属、布劳特氏菌属、瘤胃球菌属和ParaPrevotella属。至第5周滋补脾阴方药给药阶段末,比较三组肠道差异菌属显示:相比于正常组,脾阴虚组乳杆菌属与Paraprevotella属水平明显增加,瘤胃球菌属与粘放线菌属明显下降;与脾阴虚组相比较,滋补脾阴方药组乳杆菌属丰度水平显著下降,瘤胃球菌属与粘放线菌属水平增加;滋补脾阴方药组乳杆菌属、瘤胃球菌属、粘放线菌属与Paraprevotella属较正常组均无明显差异。二、脾阴虚大鼠肠黏膜机械屏障变化及滋补脾阴方药干预作用Western blotting结果显示,脾阴虚组大鼠空肠Claudin-1、Occludin蛋白水平较正常组显著降低,ZO-1蛋白表达有降低趋势;滋补脾阴方药组Claudin-1、Occludin蛋白表达相比于脾阴虚组上调,ZO-1表达略有增加,但统计学无显著差异。滋补脾阴方药给药组Claudin-1、Occludin、ZO-1表达较正常组之间未见显著性差异。采用qPCR方法检测大鼠空肠紧密连接蛋白的mRNA表达显示,相比于正常组,脾阴虚组大鼠空肠Claudin-1和Occludin mRNA表达降低,ZO-1 mRNA表达有降低趋势;滋补脾阴方药方药组Claudin-1、Occludin和ZO-1 mRNA表达较脾阴虚组均增加。滋补脾阴方药给药组Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表达与正常组比较,未见明显差异。三、脾阴虚大鼠肠黏膜免疫屏障变化及滋补脾阴方药干预作用通过ELISA法检测大鼠空肠 sIgA、IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17和 TGF-β的表达水平,结果显示脾阴虚组空肠sIgA、IL-4、IL-10、TGF-β含量较正常组相比减少,IFN-γ和IL-17含量增加;滋补脾阴方药组与脾阴虚组相比,sIgA、IL-4、IL-10和TGF-β表达水平均上升,IFN-y与IL-17表达下降,与正常组相比无明显差异。结论:1.脾阴虚造模过程中大鼠肠道菌群多样性呈动态变化:脾气虚阶段末,模型组大鼠肠道菌群多样性增加,脾阴虚阶段变化不显,至滋补脾阴方药给药阶段,脾阴虚大鼠肠道微生物群落多样性降低,滋补脾阴方药干预可增加脾阴虚大鼠肠道菌群多样性。2.脾阴虚状态下,机体肠道菌群数量与结构发生紊乱。脾阴虚证发展过程中可以使益生菌乳杆菌属水平降低,并在一定程度上增加致病菌梭菌属比例,推测乳杆菌属和梭菌属可能是脾阴虚证发展过程中的特异性菌属。脾阴虚状态下产丁酸相关细菌(罗氏菌属和丁酸弧菌属)水平的下降可能影响了肠黏膜屏障功能的正常发挥。3.滋补脾阴方药能够通过下调厚壁菌门、F/B 比例与乳杆菌属水平,增加拟杆菌门、放线菌门、瘤胃球菌属与粘放线菌属丰度,从而改善脾阴虚大鼠失调的肠道菌群结构。4.脾阴虚大鼠空肠组织Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白和mRNA表达降低,可能是导致肠黏膜机械屏障受损的重要因素之一。滋补脾阴方药能够通过上调大鼠空肠组织紧密连接蛋白Claudin-1、Occludin和ZO-1 mRNA表达,并增加Claudin-1和Occludin蛋白表达,改善脾阴虚大鼠肠黏膜机械屏障损伤,对肠道机械屏障具有明显的修复作用。5.脾阴虚大鼠肠道Th1/Th2、Th17/Treg细胞因子比例失衡,肠黏膜免疫屏障功能显著下降。滋补脾阴方药可以通过调节Th1/Th2、Th1 7/Treg细胞分泌的细胞因子比例,有效改善脾阴虚大鼠肠黏膜免疫功能的异常变化,从而减轻肠黏膜免疫屏障损伤。
【学位授予单位】：南京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

序列长度分布,纵轴,横轴,纵坐标

逦南京中医药大学硕士学位论文逦逡逑注．？与正常组比较，〃＞＜０．００］0逡逑２．模型评价逡逑造模结束后，对大鼠进行生物学特征评价：正常组大鼠活动灵敏，眼神灵逡逑活，毛发有光泽，二便正常；脾阴虚组大鼠体质量降低，背毛枯槁无光，易出逡逑现咬斗行为，粪便千燥，摄食量时增时减，饮水量增多，肛温呈升高趋势。综逡逑上，实验结果基本符合脾阴虚动物模型评估标准［５］。逡逑３．脾阴虚造模过程中大鼠肠道菌群动态变化情况逡逑３．１肠道菌群１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因测序深度评估逡逑第１－５周所有实验样品共产生４３９４２８１条有效的１６Ｓ邋ｒＲＮＡ基因序列。所逡逑测序列长度大约分布在４２４邋ｂｐ－４５３邋ｂｐ，其中数目最多的为４２５邋ｂｐ，与所测的１６Ｓ逡逑ｒＲＮＡ的Ｖ３－Ｖ４区条带长度大致相符（见图２－１－１）。逡逑Ｌｅｎｇｔｈ邋Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ逡逑

主坐标,肠道菌群,情况,阶段

逦邋第二章实验研究逦逡逑离的ＰＣｏＡ主坐标分析结果显示（见图２－１－４），正常组、脾阴虚组以及滋补脾逡逑阴方药组第１－５周肠道菌群差异显著：正常组各样本在ＰＣ１水平上（２０．８５％）逡逑呈连续性，无法明显区分。脾阴虚组第１－５周肠道菌群组内差异较小。脾阴虚逡逑组和滋补脾阴方药组在ＰＣ１水平上贡献度最大（分别为２１．０７％、２１．１１％）。脾逡逑阴虚组在ＰＣ１水平上可将脾气虚阶段与脾阴虚阶段明显区分，说明在脾阴虚发逡逑展过程逡逑中，肠道菌群变化显著，且在脾气虚阶段与脾阴虚阶段具有明显差异。逡逑（ａ）逦（ｂ）逡逑

非度量,多维尺度,组成分析,分类学

注：ｃ代表正常组，ｓ代表脾阴虚组，ｚ代表滋补脾阴方药组。逡逑图２－１－５第１－５周三组基于ＵｎｉＦｒａｃ距离ＮＭＤＳ非度量多维尺度未加权分析情逡逑况逡逑３．４分类学组成分析逡逑３．４．１肠道菌群在门水平上的变化逡逑２５逡逑

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