白藜芦醇抗肠道病毒71型至手足口病的作用机制研究

发布时间：2020-07-14 06:14

【摘要】：肠道病毒71(EV71)感染后,会引起机体发生免疫反应,其中自然杀伤细胞引起的固有免疫就是第一道防线。在本研究中,通过流式细胞术及细胞因子微球检测技术(CBA)方法检测EV71感染后手足口病患者NK细胞亚群以及细胞因子变化情况;另外,许多研究表明,白藜芦醇(Res)具有多种生物学功能,如心血管保护、突变治疗、抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤等。本研究中通过RES被用于保护横纹肌肉瘤(RD)细胞免受EV71损伤,进而对相关机制进行了探讨。研究表明,EV71感染后,NK细胞亚群中NKG2A+较正常对照组明显升高,细胞因子(IL-2,IL-6,IL-10,IL-17a)在手足口病患者中明显升高。RES抗EV71病毒作用的研究中发现,VP1蛋白在加入RES的实验组中分泌明显减少;RES功能实现的一个前瞻性机制是,RES可能抑制氧化应激介导的Perk/EIF2α/ATF4信号通路,下调自噬途径,抵抗EV71诱导的RD细胞损伤。此外,RES治疗显著抑制了EV71感染引起的分泌性炎症因子,如IL-6、IL-10和TNF-α。同时,氧化应激抑制剂或内质网应激(ERS)抑制剂或自噬抑制剂阻断了RES对EV71感染的RD细胞的抗病毒作用。这些结果表明,RES通过抑制氧化应激介导的ERS/自噬信号通路,减弱了EV71诱导的病毒复制和炎症效应。第一部分:EV71感染后NK细胞亚群和细胞因子检测目的:研究手足口病病人与健康对照者之间NK细胞亚群及细胞因子的变化情况。方法:收集吉林大学第一医院2016年7月至2017年9月门诊及住院病人70人,16名健康对照者标本来自长春市朝阳区疾病预防控制中心学龄前健康体检儿童。采用流式细胞术检测NK细胞亚群变化,细胞因子微球检测技术(CBA)检测细胞因子变化。结果:NKG2A~+CD3~-CD16~+CD56~+细胞亚群病人组较正常对照组比例明显升高,细胞因子(IL-2,IL-6,IL-10,IL-17a)在病人组较正常对照组明显升高。以上结果通过统计学分析,P0.05,具有统计学差异。结论:手足口病患儿急性期检测NK细胞亚群NKG2A~+明显升高,同时,细胞因子IL-2,IL-6,IL-10,IL-17a明显升高,以上指标可作为EV71感染后炎症标志物。第二部分:白藜芦醇抗肠道病毒71的机制目的:建立EV71感染的RD细胞模型,进一步明确RES的抗EV71作用相关的机制。方法:采用免疫荧光法检测RES对EV71感染RD细胞内的ROS生成的影响,通过试剂盒测定细胞内MDA及SOD水平,用免疫印迹法及免疫荧光法测定细胞内VP1、内质网应激相关蛋白、自噬相关蛋白的表达,用Millipex磁珠和flexmap3d测定感染EV71的RD细胞中IL-6、IL-10和TNF-α的浓度。结果:免疫荧光法检测结果示,EV71感染可导致细胞内ROS水平明显增加,此现象可被RES显著抑制。试剂盒测定结果显示,EV71感染可导致细胞内MDA水平明显增加且SOD水平明显降低,此现象可被RES显著抑制。免疫印迹法结果示,(1)EV71感染可导致细胞内内质网应激相关蛋白表达明显增加,此现象可被RES显著抑制,预处理氧化应激抑制剂可显著阻断RES的作用;(2)EV71感染可导致细胞内自噬相关蛋白表达明显增加,此现象可被RES显著抑制,预处理内质网应激抑制剂可显著阻断RES的作用;(3)EV71感染可导致细胞内VP1表达明显增加,此现象可被RES显著抑制,预处理氧化应激抑制剂、内质网应激抑制剂及自噬抑制剂可显著阻断RES的作用。细胞因子检测结果示,EV71感染可导致细胞内细胞因子分泌明显增加,此现象可被RES显著抑制,预处理氧化应激抑制剂、内质网应激抑制剂及自噬抑制剂可显著阻断RES的作用。免疫荧光法结果示,EV71感染可导致细胞内自噬相关蛋白表达明显增加,此现象可被RES显著抑制。结论:RES通过阻断氧化应激介导的ERS/自噬途径发挥抗病毒作用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
【图文】：

吉 林 大 学 博 士 学 位 论 文IG-I 通过 5-三磷酸盐识别短链双链 RNA 和单链 RNA；而 MDA5 识别长双链 RNA[19]；NLRP 分子能够募集 CARD 接头蛋白 ASC 等分子，进一活化激活前半胱天冬酶-1（caspase-1）和诱导 caspase-1 自我裂解，从而与 IL-1、IL-18 和 IL-33 等重要炎症细胞因子的生成和剪切[20，21]。总之，Vs 不同种属通过活化不同 PRRs 信号通路中的分子，从而刺激宿主天然疫反应。

如图 2.1。患者可出现神经系统并发症（无菌性脑膜炎、脑炎、脑髓炎、迟缓性瘫痪、自主神经失调），或者心肺并发症（肺水肿、肺出或循环呼吸衰竭），或者两者都有。采集后的全血置于 4℃冰箱，健康照的16份标本置于干冰中转运至实验室，4小时内进行单个核细胞提取

透腥竞?NK 细胞亚群及相关细胞因子变化的研究29图 2.2 细胞因子标准品倍比稀释示意图2.2.6.3 混合人 Th1/Th2/Th17 细胞因子捕获微球（1）确定实验管数（包括标准品和对照管），并计算每种捕获微球的实际需要量。吸取每种捕获微球前需充分涡旋 3-5 秒，以确保混合液中的微球数量足够；（2）离心混合好的捕获微球，200g /5min，弃上清；（3）加入与弃掉上清等体积的血清增强缓冲液，充分涡旋混匀，并室温避光孵育 30min。2.2.6.4 实验步骤（1）涡旋混合捕获微球，所有的待检管都加入 50ul，每加 5 管混匀一次；（2）S1-S10 标

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本文编号：2754611