槲皮素对肝脂肪变性中线粒体稳态与自噬的调控及Frataxin的介导机制

发布时间：2020-07-14 21:14

【摘要】：目的:探讨槲皮素对肝脂肪变性中线粒体稳态及线粒体自噬失衡的保护效应,以及Frataxin对PINK1-Parkin线粒体自噬信号通路的介导机制。方法:48只雄性C57BL/6J小鼠随机分成低脂对照组(LFD,10%脂肪供能)、高脂模型组(HFD,60%脂肪供能)、槲皮素干预组(HFD+Q,100 mg/kg·bw)和槲皮素对照组(LFD+Q,100 mg/kg·bw),喂养10周后观察小鼠肝脏脂质沉积情况及血脂水平;qRT-PCR测定肝脏脂质代谢及线粒体融合、分裂、生物合成和线粒体自噬相关基因表达;透射电镜观察肝线粒体超微结构与自噬状态的变化;Western blot测定肝线粒体自噬相关通路蛋白的表达,免疫荧光染色观察Parkin的线粒体转位。针对FXN基因设计和筛选寡核苷酸干扰序列,制备慢病毒载体转染HepG2细胞(Lv-FXN-mcherry)和空载体(Lv-mcherry),经游离脂肪酸(FFAs,2 mmol/L,油酸㑳棕榈酸=2㑳1)和槲皮素(100μmol/L)单独或联合处理24 h(同时设正常细胞对照),比较各组细胞的脂质沉积水平及Frataxin、PINK1、Parkin表达的变化,激光共聚焦检查自噬小体与线粒体的共定位和Parkin的线粒体转位。在此基础上,利用p53抑制剂PFT-α和HIF-1α抑制剂PX-478处理HepG2细胞,观察上述指标的变化。结果:与LFD相比,10周的高脂喂养导致血清甘油三酯与总胆固醇水平明显升高,肝脏脂肪沉积尤为明显,肝脏脂肪酸合成酶(FAS)和固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)的mRNA水平升高(P0.05);肝线粒体结构改变,膜电位和呼吸控制率下降(P0.05),部分肝线粒体生成相关基因表达下降(P0.05),线粒体融合及分裂相关基因均表达下降(P0.05);肝LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、PINK1和Frataxin的蛋白水平显著下降(P0.05),p62蛋白表达上升(P0.05),肝线粒体上Parkin和LC3Ⅱ的表达显著下降(P0.05),Parkin与VDAC1的共定位减少。经槲皮素干预后,小鼠血脂与肝脏脂肪沉积有了明显改善,FAS基因表达降低(P0.05),但SREBP-1c进一步升高(P0.05);肝线粒体形态正常,膜电位和呼吸控制率上升(P0.05),肝线粒体生成相关基因、线粒体融合蛋白1及线粒体分裂蛋白1基因表达均上升(P0.05);肝LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、PINK1、Parkin和Frataxin的蛋白水平表达增加(P0.05),p62蛋白表达下降(P0.05),肝线粒体上Parkin和LC3Ⅱ的蛋白水平上调(P0.05),Parkin与VDAC1的共定位增加。在HepG2细胞中,与对照组相比,FFAs处理组细胞内有大量的脂滴蓄积,Frataxin表达降低(P0.05),PINK1-Parkin介导的线粒体自噬被抑制,Parkin与VDAC1、TOM20与LC3的共定位区域减少;槲皮素干预后可逆转上述改变,上调Frataxin的蛋白水平(P0.05)。Lv-FXN-mcherry细胞中,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、PINK1和Parkin蛋白表达较Lv-mcherry细胞均表达下降(P0.05)。在FFAs处理下,与Lv-mcherry细胞相比,Lv-FXN-mcherry细胞内脂滴蓄积明显,TG水平上升(P0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、PINK1和Parkin蛋白表达进一步降低(P0.05);槲皮素干预后,Lv-FXN-mcherry细胞内TG水平下降,PINK1和Frataxin表达增加(P0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1和Parkin蛋白无显著差异(P0.05)。HepG2细胞中,p53的抑制剂PFT-α可抑制Frataxin的表达(P0.05),在FFAs和PFT-α的共处理下,Frataxin进一步降低(P0.05),而此时槲皮素对Frataxin的水平无显著影响(P0.05)。结论:Frataxin介导了肝脂肪变性中PINK1-Parkin线粒体自噬,槲皮素能上调线粒体蛋白Frataxin的表达,激活PINK1-Parkin介导的线粒体自噬,从而维持线粒体的正常稳态,缓解肝脂肪变性及脂质代谢紊乱。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】