生姜挥发油成分分析及其主要活性成分6-姜酚的抗炎机制初步探究

发布时间：2020-07-15 13:41

【摘要】：目的:生姜为姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鲜根茎,是最为常见的药食同源中药食材。本文对生姜、干姜及干姜炮制品挥发油成分进行研究,并探讨其药理作用差异的可能原因;通过检测不同产地生姜和直接压榨姜汁中6-姜酚含量,为生姜相关产品开发及产地提供参考依据和新思路;通过MOE等软件预测主要成分6-姜酚潜在的抗炎作用靶点,并通过分子生物学相关技术对预测抗炎靶点进行验证,探索生姜主要生物活性成分6-姜酚的抗炎机制。为生姜相关药物的靶点选择及研发提供理论研究基础。方法:采用最常用的水蒸气蒸馏法提取生姜、干姜、炮姜和姜炭的挥发油,用乙醚稀释挥发油后采用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)进行化学成分分析,将结果进行对比。采用醇回流提取法,提取五种不同产地生姜中的6-姜酚;采用直接压榨法得到姜汁及姜渣,并采用醇回流法提取鲜姜和姜渣中6-姜酚;通过高效液相色谱法检测各样品中的6-姜酚含量并对其进行比较分析。利用MOE软件探究6-姜酚潜在的抗炎作用靶点,并以此为基础进行6-姜酚抗炎机制的研究。采用MTT法确定6-姜酚的给药浓度;采用ELISA法检测6-姜酚对炎性因子TNF-α、IL-6及cAMP分泌的影响;采用Western Blot法检测6-姜酚对炎症细胞内磷酸二酯酶4表达的影响。结果:从生姜、干姜、炮姜、姜炭的挥发油中共鉴定出化合物48种,其中生姜挥发油30种,干姜挥发油36种,炮姜挥发油35种,姜炭挥发油26种。其中生姜中含量较多的有β-水芹烯、柠檬醛、莰烯等;干姜中主要含有姜烯、β芹倍半水芹烯、β-水芹烯等;炮姜中主要含有姜烯、β-水芹烯等;姜炭中主要有龙脑、姜烯、β-水芹烯等。各产地生姜中6-姜酚含量分别为:辽宁0.123 mg/mL、山东0.121mg/mL、云南0.176 mg/mL、四川0.274 mg/mL、江西0.264 mg/mL;在95.57 g生姜中6-姜酚含量为121.9 mg,66 mL姜汁中的6-姜酚含量为55.39 mg,为生姜中6-姜酚总含量的45.46%,4.98 g姜渣中测得6-姜酚含量为36.68 mg,为生姜中6-姜酚总含量的30.10%。PDE4为经PharmMapper网站筛选出的可能的6-姜酚抗炎作用靶点,PDE4与6-姜酚经MOE模拟对接后显示,该靶点与6-姜酚有着良好的对接;25-100μg/mL浓度的6-姜酚给药组与空白组比较P0.05,表示此浓度范围中6-姜酚对RAW264.7细胞活力无影响;LPS可激活RAW264.7,使其活力显著增加,25-100μg/mL浓度的6-姜酚给药组与LPS对照组比较P0.05或P0.01,即显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的活性;6-姜酚给药组与LPS对照组相比,其TNF-α、IL-6的分泌均显著降低,且其对TNF-α、IL-6分泌的抑制程度均与其给药浓度呈正相关;而给药组cAMP的分泌量较LPS对照组明显升高,且升高程度与给药浓度亦呈正相关;LPS诱导的RAW264.7细胞中PDE4蛋白的表达量与空白组相比P0.05,即RAW264.7细胞经LPS处理后其PDE4的蛋白表达量有显著增加;25-100μg/mL浓度的6-姜酚给药组与LPS组相比P0.05或P0.01,即6-姜酚可显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞PDE4蛋白的表达,且其抑制程度与其给药浓度呈正相关。结论:生姜、干姜及干姜炮制品的挥发油既有相同成分,也各有其特征成分。姜挥发油中所含的化合物种类和含量在不同的炮制过程中都有不同程度的变化;而成分上的变化很有可能导致了炮制品药理作用差异;通过高效液相色谱法检测出的各产地生姜6-姜酚含量中,四川及江西两地生姜中6-姜酚浓度显著高于其他三产地。直接压榨法得到的姜汁6-姜酚含量达到45.46%,即直接压榨法可作为一种简单可行的方法提取生姜中的6-姜酚,同时对直接压榨姜汁的产品化可行性提供了科学依据和参考价值;PDE4与6-姜酚经MOE进行模拟对接后的评分结果说明PDE4很有可能是6-姜酚抗炎作用的潜在靶点,以此为基础选定PDE4为靶点对6-姜酚的抗炎作用进行后续研究;25-100μg/mL浓度的6-姜酚对RAW264.7细胞活力无影响;LPS可使RAW264.7细胞处于激活状态,细胞活力显著增强,而25-100μg/mL浓度的6-姜酚则抑制了激活状态下RAW264.7细胞的细胞活力,确定了本实验的给药浓度为25-100μg/mL;LPS组与空白组相比TNF-α、IL-6分泌显著增加,cAMP分泌显著降低,说明10μg/mL LPS可使RAW264.7细胞至炎;而25-100μg/mL浓度的6-姜酚对LPS诱导的RAW264.7细胞TNF-α、IL-6分泌起抑制作用,但会促进cAMP的分泌,说明该浓度范围的6-姜酚能够有效的抑制RAW264.7细胞炎症,起到抗炎作用;经LPS诱导后致炎的RAW264.7细胞内PDE4含量显著增加,而经25-100μg/mL浓度的6-姜酚给药后的炎症细胞内PDE4表达被显著抑制,说明6-姜酚对RAW264.7细胞具有抗炎作用,且这种抗炎作用的机制很可能是6-姜酚抑制了炎症细胞内PDE4的蛋白表达。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5;R284.1
【图文】：

在上述条件下进行分析，总离子流图见图1.1-1.4，所得质谱图经过计算机数据处理和 WILEY 标准质谱图库检索鉴定出的各种化学成分，结果见表 1.2。3 结果由采用水蒸气蒸馏法提取姜及其炮制品四种药材的挥发油，其中干姜的出油率最高为 1.25 mL/100 g(1.25%,V/W)，生姜的出油率最低为 0.20 mL/100 g（0.20%，V/W），其出油率见表 1.1。表 1.1 生姜、干姜及干姜炮制品的出油率药材 药材重量/g 挥发体积/mL 出油率(mL/100g)生姜 100.00 0.20 0.20干姜 20.00 0.25 1.25炮姜 20.03 0.15 0.75姜炭 20.04 0.18 0.90经气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）检测 4 种药材挥发油，分析后所得的总离子流图如图 1.1 至图 1.4 所示。

干姜的挥发油总离子流图

图 1.3 炮姜的挥发油总离子流图图 1.4 姜炭的挥发油总离子流图经 NIST 质谱库检索并结合文献分析后，4 种分别鉴定出的化学成分结果见表1.2：生姜、干姜及干姜炮制品的挥发油中共鉴定出化合物 48 种，其中生姜 30 种，干姜 36 种，炮姜 35 种，姜炭 26 种。这 4 种炮制品的共有成分为 17 种，分别为α-蒎烯、β-月桂烯、β-水芹烯、β-倍半水芹烯、姜烯、莰烯、α-金合欢烯、α-没药醇、龙脑、樟脑、乙酸香叶酯、α-柠檬醛、β-柠檬醛、β-榄香烯、揽香醇、桉叶油醇、反式-橙花叔醇。干姜、炮姜和姜炭的共有成分有 6 种，分别为α-水芹烯、α-柏木烯、

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本文编号：2756562