低浓度雷公藤甲素通过干扰DNA损伤修复逆转急性淋巴细胞白血病耐药的研究

发布时间：2020-07-15 14:09

【摘要】：成人急性淋巴细胞白血病(acutelymphoblasticleukemia,ALL)约占成人急性白血病的20%-30%1,ALL细胞对常规化疗药物的耐药是导致成人ALL患者疗效不佳的重要原因2。因此,深入研究ALL细胞对常规化疗药物的耐药机制以及寻找有效药物逆转其耐药成为成人ALL治疗迫切需要解决的问题。目的:探讨低浓度雷公藤甲素(triptolide,TPL)能否逆转ALL对阿糖胞苷(cytarabine,arac)的耐药,并进一步研究其逆转耐药的机制,为难治/复发(relapsed or refractory,R/R)成人ALL患者提供治疗选择。方法:1.通过浓度递增的方法建立对arac耐药的ALL细胞株NALM-6/R,同时收集临床难治/复发原代ALL细胞作为本研究的研究对象,2.观察IC20浓度的TPL联合arac对耐药ALL细胞的增殖抑制和诱导凋亡的作用;3.通过建立耐药细胞株动物模型,进一步验证IC20的TPL联合arac体内杀伤耐药ALL的能力。4.采用western blotting、流式细胞术等方法检测DNA损伤修复相关蛋白变化,探讨TPL逆转ALL耐药的可能机制。结果:1.建立了对5 μMarac耐药的NALM-6/R细胞株,同时其获得对0.5 μM阿霉素(ADM)的交叉耐药。2.IC20 的 TPL 联合5 μM arac 或 0.5 μM ADM 作用 NALM-6/R 48h 的 IC50 值分别为:2.25 ± 0.72(TPL+arac)、0.32 ± 0.081(TPL+arac),较单药 arac、ADM分别逆转耐药 20、15.16 倍(p0.01)。IC20 的 TPL 联合5μ M arac 或 0.5 μM ADM作用NALM-6/R 48h后细胞凋亡比例分别为52.40 ± 4.45%和24.60 ± 3.23%,较单药 5μM arac(10.21±0.07%)和 0.5μMADM(5.56±0.04%)明显增强(p0.01)。IC20 的 TPL 联合5 μM arac 或 0.5 μM ADM 作用 12 例 R/R 原代 ALL 细胞48h后凋亡细胞比例分别为53.51±12.44%、51.50±15.44%,较单药5μM arac(40.87±5.73%)和 0.5μMADM(42.23±9.92%)同样明显增强(p0.01)。进一步根据复发和(或)难治时的WBC进行分组分析:WBC≥100×109/L组细胞凋亡比例高于 WBC100×109/L 组,TPL+arac 组分别为:61.36±10.12、42.52±3.61(p0.05);TPL+ADM 组分别为:59.67±15.12、40.08±5.72(p0.05)。3.动物模型接受TPL+arac治疗5天,其外周血、骨髓组织切片肿瘤细胞均较单药组明显下降,且联合治疗组脾脏重量0.17 ±0.26 g,较ddH2O、arac和TPL组降低,分别为:0.31± 0.23 g、0.28 ±0.01g 和0.33 ±0.56 g(p0.0001)。此外,联合治疗组生存时间较对照组和单药治疗组明显延长(p=0.002)。4.IC20的TPL联合5μM arac或0.5 μM ADM作用NALM-6/R 48h线粒体膜电位去极化细胞比例53.8 ±1.23%、51.8 ±0.79%,较单药5μM arac(15.2 ±0.76%)和0.5μMADM(20.5±0.37%)明显下降(p0.001)。IC20 的TPL联合5μMarac或0.5 μM ADM作用NALM-6/R 48h后ROS水平较单药5 μM arac、0.5νM ADM 提高9倍和5倍;经ROS清除剂NAC预处理NALM-6/R2h,不仅降低联合处理所致的ROS水平,而且凋亡细胞比例明显降低,分别为24.60 ±3.23%、14.15 ±2.41%(p0.001)。采用FACS及Western blotting方法检测DNA损伤标志及修复相关蛋白。结果表明,较单药组,联合处理后增加了 γ-H2AX和Caspase9表达,相反DNA修复相关蛋白pChk1、pChk2的水平明显降低。结论:本研究证实IC20的TPL具有体内外逆转ALL多药耐药的作用。其机制可能是通过诱导ROS产生,增强DNA损伤、抑制DNA修复相关蛋白,从而启动细胞内凋亡通路,促进细胞凋亡。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285
【图文】：

４５．００士３．２７邋（ｎＭ）和４．８５士０．９５邋（ｎＭ）下降到联合后的２．２５±０．７２邋（ｎＭ）和０．３２±０．０８１逡逑（ｎＭ），逆转耐药倍数分别为２０．００和１５．１６，差异均具有显著统计学意义（Ｐ＜０．０１）逡逑（表邋１－２，图１－１）。逡逑２０逡逑

相比ｄｄＨ２０、邋ａｒａｃ和ＴＰＬ组，接受ＴＰＬ＋邋ａｒａｃ治疗组外周血人源性逡逑ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋细胞比例明显下降；在骨髓组织切片水平，也显示一致性结果，见逡逑图２－１，２－２，邋２－３。不仅如此，接受ＴＰＬ＋ａｒａｃ治疗组脾脏重量０．１７邋±０．２６邋ｇ，较逡逑ｄｄＨ２０、邋ａｒａｃ邋和邋ＴＰＬ邋组降低，分别为：０．３１邋±邋０．２３邋ｇ、０．２８邋±邋０．０１邋ｇ邋和邋０．３３邋士逡逑０．５６邋ｇ，差异具有统计学意义（ｐ＜邋０．０００１），见图２－４。逡逑ａ逡逑？／邋！－？－１逦，？？邋ＨＩＦ＂逦？ｖ逡逑＇■：逦－；逡逑，ｅ，？＊＇逦？逡逑’’邋ｍ邋．二－Ｉ逦＇＊邋Ｔ逡逑ｉｓｏｔｙｐｅ逦ｄｄＨ２０逡逑ｍ逡逑％逦３邋－逦５邋４０％．逦＃？逦？？逦Ｉ逡逑８邋．．邋，，邋，■逡逑；？＇逦＾逦

Ｃｏｎｔｒｏｌ邋ＴＰＬ邋ａｒａＣ邋ＴＰＬ＋ａｒａＣ逡逑图２－２：采用流式细胞技术检测，分别接受ｄｄＨ２０、ａｒａｃ、ＴＰＬ或ＴＰＬ＋ａｒａｃ治疗５逡逑天后，外周血人源性ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋细胞比例柱状图（＊：与对照组及单药治疗组相逡逑比，差异具有统计学差异，ＰＣ０．００１）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２．邋Ａ邋ｃｏｌｕｍｎ邋ｃｈａｒｔ邋ｓｕｍｍａｒｉｚｅｓ邋ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ邋ｒａｔｉｏｓ邋ｏｆ邋ｈｕｍａｎ邋ＣＤ４５＋ＣＤ１９＋％邋ｃｅｌｌｓ邋ａｆｔｅｒ逡逑ｄｒｕｇ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ邋ａｓ邋ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ邋ａｂｏｖｅ邋ｄｅｓｃｒｉｂｅｒｄ邋（ｍｅａｎ邋士邋ＳＤ）．邋（＊：邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋，ＴＰＬ逡逑ｏｒ邋ａｒａｃ邋ｇｒｏｕｐ，Ｐ＜０．００１）逡逑ｂ逦ｃｏｎｔｒｏｌ逦ＡｒａＣ逡逑灥灥逡逑ＴＰＬ逦ＴＰＬ＋ＡｒａＣ逡逑图２－３：骨髓组织Ｈ＆Ｅ染色显示，分别接受ｄｄＨ２０、ａｒａｃ、ＴＰＬ或ＴＰＬ＋ａｒａｃ治疗逡逑５天，骨髓组织内肿瘤细胞密度差异逡逑３４逡逑

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本文编号：2756594