热痹清片在佐剂大鼠单次给药及正常大鼠多次给药的药动学研究

发布时间：2020-07-16 18:45

【摘要】：目的热痹清片是治疗虚热型类风湿关节炎的中成药,方中含有制马钱子。制马钱子治疗风湿病的主要有效成分为马钱子碱和士的宁,同时两者也是毒性成分。实验研究建立热痹清片中马钱子碱和士的宁的血药浓度分析方法,并以制马钱子粉为对照,研究其在大鼠佐剂关节炎(AA)模型下及正常大鼠多次给药的药动学过程,以探讨其体内的药动学规律,为热痹清片在临床上安全合理应用和开展深入研究奠定基础。方法1.热痹清片中马钱子碱和士的宁血药浓度分析方法的建立。采用高灵敏度的超高液相色谱-四极杆轨道阱高分辨质谱仪(UPLC-Q-Orbitrap HRMS),以马钱子碱、士的宁响应值及峰形作为评价指标,以盐酸克伦特罗为内标,考察质谱和色谱测定条件,优选流动相的比例和进样时间,并进行相关方法学考察。2.热痹清片中马钱子碱和士的宁在AA模型大鼠体内的药动学研究。(1)造模随机取SD雄性大鼠36只,在其右后足注射弗氏完全佐剂0.1ml进行造模,于造模后第1、3、5、8、10、12、14、15、16天测定各组大鼠足跖部肿胀体积、关节红肿程度和体重,计算足趾肿胀率、关节炎指数、增重率,初步判断造模是否成功。并在药动学实验取血完毕后,腹主动脉取血,酶联免疫法测定血清中IL-1β、TNF-α含量,并取脾脏、胸腺,应用SPSS17.0软件分析免疫器官脾脏、胸腺指数,再次验证造模是否成功。(2)分组将造模成功的大鼠,随机分为制马钱子粉模型组、热痹清片模型组,每组6只。另取健康SD雄性大鼠12只,随机分为热痹清片组、制马钱子粉组作为对照。(3)给药剂量与取血各组均按马钱子碱0.12 mg/kg的剂量灌胃给药。于给药后5、10、20、30、45、60、90、120、180、300、420、540、720min,眼眶静脉采血。采用液质法测定各给药组大鼠体内血浆中马钱子碱和士的宁的浓度。(4)实验数据处理方法采用DAS3.0软件运算马钱子碱和士的宁的药动学参数,SPSS17.0软件计算药动学参数的差异,进行t检验分析。3.正常大鼠多次给予热痹清片的药动学研究。取SD雄性大鼠随机12只,分为热痹清片组、制马钱子粉组,每组6只。按马钱子碱0.12mg/kg的剂量灌胃给予相应药物,每天给药三次,连续灌胃6天。自第三天起,每天于第二次灌胃后180、300、420min,分别对各组大鼠进行眼眶静脉取血。在第七天早上灌胃给药后5、10、20、30、45、60、90、120、180、300、420、540、720min,眼眶静脉取血,应用液质法测定大鼠体血浆中马钱子碱和士的宁的浓度,DAS3.0软件计算马钱子碱和士的宁的药动学参数。SPSS17.0软件计算药动学参数的差异,进行t检验分析。结果1.血药浓度测定方法。质谱条件:采用电喷雾离子源,选用正离子,sheath gas flow rate:10,spray voltage(KV):3.5,spray current(uA):0.3,capillary temperature(℃):320,Aux gas heater temperature:50。马钱子碱、士的宁、盐酸克伦特罗的m/z分别395.199、335.177、279.161。色谱条件:流动相30%乙腈:70%0.15%甲酸溶液,柱温35℃,流速0.2mL/min,进样量5μL,进样时间5min。马钱子碱和士的宁的线性范围分别为0.12~15ng/mL、0.24~30.75ng/mL,两者的平均回收率分别为84.93%、83.37%,RSD为6.06%,基质效应分别为84.92%、84.29%,RSD为3.01%。最低检测限为:马钱子碱0.06ng/mL,士的0.12ng/mL,两者的RSD分别为4.78%,4.77%。2.热痹清片中马钱子碱和士的宁在AA大鼠体内的药动学研究。制马钱子粉在正常大鼠与AA大鼠体内马钱子碱和士的宁的药动学参数的平均数分别为:T_(max)为1.50、1.58h和0.32、0.28h;C_(max)为2.26、3.45ng/mL和3.45、21、47ng/mL;AUC为35.7、156.56和29.65、93.82 ng·min·L~(-1),T_(1/2)为6.58、6.92h和2.51、2.13h;CL/F为623339、65441L·kg~(-1)·min~(-1)和810118、823325L·kg~(-1)·min~(-1);热痹清片在正常大鼠与AA大鼠体内马钱子碱和士的宁的药动学参数的平均数分别为:T_(max)为1.50、1.50h和0.64、0.73h,C_(max)为2.68、7.16ng/mL和5.27、21.57ng/mL,AUC为16.52、148.42和52.4、175.02ng·min·L~(-1),T_(1/2)为4.70、5.63h和3.57、2.50h,CL/F为71250、81818 L·kg~(-1)·min~(-1)和91349、93217L·kg~(-1)·min~(-1)。AA大鼠体内马钱子碱和士的宁参数T_(1/2)提前1.13、3.13h,T_(max)提前0.86、0.77h,C_(max)是正常大鼠的1.96、3.01倍,CL/F是正常大鼠的1.28、1.13倍;马钱子碱和士的宁在正常大鼠与AA大鼠体内的药动学过程均符合一室模型。热痹清片AA组和制马钱子粉AA组之间,马钱子碱和士的宁的药动学参数AUC_(0-t),T_(max)有差异。3.正常大鼠多次给予热痹清片的药动学研究。热痹清片中马钱子碱和士的宁从第三天给药后达到了稳态。马钱子碱和士的宁的血药浓度维持在0.14~0.24 ng/mL,0.91~2.11ng/mL。马钱子碱和士的宁在两组大鼠体内的药动学过程均符合一室模型。末次给予热痹清片后马钱子碱和士的宁在的主要药动学参数分别:T_(max)分别为1.50、1.08h,C_(max)分别为4.46、18.74ng/ml,AUC_(0~t)分别为60.10、215.62ng·min·L~(-1),CL/F分别为88991、51352L·kg~(-1)·min~(-1);制马钱子粉中马钱子碱和士的宁的在大鼠体内的主要药动学参数:T_(max)分别为1.33、0.71h,C_(max)分别为3.82、15.27ng·ml~(-1),AUC_(0~t)分别为47.2、129.13ng·min·L~(-1),CL/F分别为56182、20408L·kg~(-1·)min~(-1)。结论1.本实验建立的测定大鼠血浆中马钱子碱和士的宁含量分析方法,专属性强,灵敏度高、检测结果准确稳定,可以作为制剂中马钱子碱和士的宁的血药浓度的含量测定。2.热痹清片中马钱子碱和士的宁的药动学过程均符合一室模型,且两者在AA模型下与正常大鼠体内的药动学参数相比,热痹清片中马钱子碱和士的宁生物利用度增加、吸收增加、消除加快。制马钱子粉AA组与热痹清片AA组比较,马钱子碱和士的宁达峰时间后延,吸收量增多。说明复方中其他药味对其体内过程有影响。3.正常大鼠多次给予热痹清片,马钱子碱和士的宁在第三天第二次给药达到稳态。两者的血药浓度没有随着维持剂量的给药次数的增加而叠加递增,并且停止给药后,二种成分在体内能够迅速消除,且末次给药后两者的药动学行为均符合一室模型,提示该药物在安全剂量内几乎不会造成体内蓄积性中毒现象。制马钱子粉和热痹清片中马钱子碱和士的宁药动学参数有显著差异,说明复方配伍对制马钱子在大鼠体内的过程有显著影响。
【学位授予单位】：河南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5
【图文】：

液相色谱,内标,马钱子,士的宁

采用177、高效.1 流实验 1、用正离子峰盐酸克伦效液相色谱流动相比例验选择乙腈-图 2 。编号A图 1.马钱子峰，三者离子特罗：279谱条件的建立的选择0.15%甲酸表 1乙腈（%）0.15水溶40F.内标采用子碱、士的宁子强度最高.161。立酸水溶液为流不同比例% 甲酸溶液（%）60士的多个用负离子扫描宁、内标的分高时的 m/z 分流动相。不例流动相峰形峰形的宁、马钱子个峰出现，描图谱分子正负离子分别为马钱不同比例流动形及保留时间子碱均有内标有裂子峰图钱子碱：395动相峰形及结果保留时间马钱子5.199、士及保留时间间子碱

血浆,士的宁,马钱,内标

结果5min、的含量.2 线性精密、3.758、3.8入上述定。以加权系0.1736马钱子A.空白果显示检测1.23min、量分析时无干性关系密吸取适量的5、1.875、84、1.92、0述不同浓度的以马钱子碱、系数进行线669x-0.0049子碱和士的宁白血浆 B.空白血图 4测到马钱子1.62min，干扰物质存的混合对照0.94、0.460.96、0.48、的对照品溶士的宁与线性回归，91567，R2=宁分别在 0血浆中加对照品各血浆中马钱碱、士的宁且在正常大存在。照品溶液，、0.23 、00.24 ng/m溶液，余按“内标峰面积分别得到马=0.9930；士.12～15ng/品、内标 C.正钱子碱和士的宁宁、内标物大鼠血浆和分别加入0.12ng/mLmL 的对照品“2.4”项下处积比值为 y马钱子碱、士的宁：y=/mL、0.24～正常大鼠血浆宁的总离子流图物盐酸克伦和病理模型甲醇稀释成，士的宁的品溶液。分处理血浆、值，以对照、士的宁的=0.25946-030.75ng/mD.AA 大鼠血浆伦特罗的保大鼠的血浆成马钱子碱的浓度为 3别取大鼠血“2.3”项下色照品的浓度为的线性方程.0047241，mL 范围内有浆保留时间分浆中二种被碱的浓度为30.75、15.3血浆各 100色谱条件操为 x 值，以程。马钱子R2=0.9892有良好的线分被3μ操以子2线

色谱,马钱,士的宁

A.空白示检测1.23min、析时无干关系取适量的1.875、、1.92、0同浓度的钱子碱、数进行线9x-0.0049和士的宁5 、6。白血浆 B.空白血图 4测到马钱子1.62min，干扰物质存的混合对照0.94、0.460.96、0.48、的对照品溶士的宁与线性回归，91567，R2=宁分别在 0血浆中加对照品各血浆中马钱碱、士的宁且在正常大存在。照品溶液，、0.23 、00.24 ng/m溶液，余按“内标峰面积分别得到马=0.9930；士.12～15ng/品、内标 C.正钱子碱和士的宁宁、内标物大鼠血浆和分别加入0.12ng/mLmL 的对照品“2.4”项下处积比值为 y马钱子碱、士的宁：y=/mL、0.24～正常大鼠血浆宁的总离子流图物盐酸克伦和病理模型甲醇稀释成，士的宁的品溶液。分处理血浆、值，以对照、士的宁的=0.25946-030.75ng/mD.AA 大鼠血浆伦特罗的保大鼠的血浆成马钱子碱的浓度为 3别取大鼠血“2.3”项下色照品的浓度为的线性方程.0047241，mL 范围内有浆保留浆中碱的30.7血浆色谱为程。R2有良

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