几种萜类化合物体外抗炎活性筛选及机制研究

发布时间：2020-07-18 10:18

【摘要】：炎症是机体对损伤因子所发生的防御反应,病原体的感染和组织损伤都能引起炎症反应,可发生于任何组织和器官。对于人类健康,炎症是把双刃剑,一方面能够清除病原体和恢复组织损伤,有利于维持机体的免疫稳态;另一方面,过度的、异常的炎症反应会导致组织的病变和二次损伤,也是许多疾病的发病基础。目前临床抗炎药物开始出现不良反应,因此,寻找新的低毒高效的炎症抑制剂是我们的重要任务。天然萜类化合物是由甲戊二羟酸衍生而来的化合物,其结构类型繁多,活性丰富,并且有报道发现萜类化合物具有较好的抗炎活性,这为我们发现新抗炎药物提供了新思路。本论文运用脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7巨噬细胞体外炎症模型,对大戟属植物金刚纂(Euphorbia neriifolia L.)、火殃|(Euphorbia antiquorum)、霸王鞭(Euphorbia royleana)等植物乙酸乙酯萃取相不同馏分进行NO抑制活性筛选发现三种植物的70%和90%甲醇/水馏分具有较好的抑制活性,尤其是90%甲醇/水馏分IC_(50)分别为0.4μg/mL,15.0μg/m L,6.85μg/m L,进一步对这三种植物活性部位分离纯化获得的单体化合物,以及从缬草属植物蜘蛛香(Valeriana jatamansi Jones),雷公藤属植物昆明山海棠(T.hypoglaucum),獐牙菜属植物獐牙菜(Swertia bimaculata),槐属植物苦参(Sophoraflavescens)等其他植物中得到的共134个单体化合物进行抑制NO生成活性筛选。这些化合物包括:91个萜类化合物(环烯醚萜,倍半萜,巨大戟烷型二萜,千金子烷型二萜,贝壳烷型二萜,松香/海松烷型二萜,阿替生烷型二萜和三萜);其他结构类型的化合物有43个。筛选结果发现有17个化合物显著的抑制NO生成,分别为13个萜类化合物和3个异戊烯基黄酮以及1个木脂素类化合物。经构-效分析发现,萜类化合物母核上引入酰基可以提高活性,并随着酰基数量越多、酰基碳链越长活性越好;多元环萜类C环上的取代基类型是发挥抗炎活性的主要原因,并且松香/海松烷型二萜和巨大戟烷型二萜具有较好的抑制活性,因此,我们将对抑制活性较好这几种类型的化合物进行抗炎活性的研究和作用机制的探索。五个松香烷型二萜化合物:52、57、54、55、56,均从昆明山海棠中分离获得,其结构具有相似性,均显示出体外NO抑制活性。其中化合物52(tritophenolide)和57(triptoquinone)活性最为明显,IC_(50)分别为21.4和2.58μM,进一步采用ELISA法和Western Blot法对化合物的抗炎活性进行确认并探索其作用机制,结果显示,在LPS活化的巨噬细胞中,两个化合物都能抑制iNOS,COX-2蛋白的表达和炎症因子NO,IL-1β,IL-6,TNF-α分泌,对信号通路影响研究发现,化合物52可能主要下调MAPK(p-p38,p-JNK,p-ERK1/2)信号通路的活化,化合物57可能是同时抑制NF-κB(p-IκB)和MAPK两条信号通路的活化,进而抑制炎症因子的分泌来达到抗炎作用。另外,从金刚纂中分离得到的巨大戟烷型二萜化合物27(euphorneroid E)和28(eurifoloid A)、松香烷型二萜化合物60(antiquorine A),阿替生烷型二萜化合物72(eurifoloid N),海松烷型二萜化合物64(sandaracopimaradiene-3),均表现出体外NO抑制活性,IC_(50)分别为6.31,5.78,22.7,37.1和19.0μM。进一步机制研究发现,在LPS活化的巨噬细胞中,化合物60,72,64能够明显的抑制炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α和iNOS,COX-2蛋白表达,可能是通过下调MAPKs信号通路的活化。另外两个化合物27和28对IL-1β,IL-6和iNOS的表达体现明显的抑制作用,然而对TNF-α和COX-2的表达体现较明显的促进作用,在信号通路方面明显的下调MAPK/p38的活化,上调MAPK/erk的磷酸化水平,因此,化合物27,28作用机制需要我们进一步实验探究。
【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285;R284
【图文】：

免疫细胞,非生物性,因素,生物性

图 1-1 炎症的原因，生理和病理结果Figure 1-1 Causes of inflammation, physiological and pathological results1.1.3 参与炎症反应的主要免疫细胞和炎症介质炎症过程就是可溶性因子与细胞相互作用复杂的一个过程。当机体受到损伤或者病原体侵染时，体内免疫系统就会开启保护机制，大量的免疫细胞（immunocyte）包括 T 淋巴细胞、B 淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞和嗜碱粒和肥大细胞等会以渗出的形式到达损伤或感染部位，到达之后由致炎因素触发激活免疫细胞内的信号通路，使细胞处于活化状态[22]。致炎因素通常分为外源性和内源性两种，外源性致炎因素（Exogenous inducers）包括生物性和非生物性，生物性主要是指能够引起机体感染的病毒、细菌、寄生虫等；非生物性致炎因素是指过敏原、刺激、异物和有毒化合物。内源性致炎因素（Endogenous inducers）包括细胞来源、组织来源、血浆来源和细胞外基质来源[23]。活化的免疫细胞会分泌大量的可溶性因子，包括致炎介质（pro-inflammatorymediators）和抗炎介质(anti-inflammatory mediators)。致炎介质的是由专门白细胞

炎症因子,免疫细胞,信息流,相互作用

图 1-2 免疫细胞和炎症因子相互作用形成的信息流[10]Figure 1-2. Information flow of immune cells and inflammatory factors1.1.4 脂多糖诱导的炎症信号通路在细菌感染的炎症中，革兰氏阴性菌细胞壁表面的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是致炎性最强的内毒素，能够引起强烈的炎症反应。LPS 是革兰氏阴性菌胞壁组成成分，细菌死亡时释放到胞外发挥作用，其结构由 4 部分组成：具有毒力活性的类脂 A、多糖成分外核心、内核心、O-特异侧链。LPS 先和血清中的结合蛋白（LPS binding protein, LBP）结合，再与细胞膜上的各种受体相结合，例如，Toll 样受体（toll like receptors, TLRs）[33-34]、CD14（cluster of differentiation 14）[35]和髓样分化蛋白-2（myeloid differentiationa-2, MD-2）[36]，结合后激活细胞内一系列的蛋白信号级联转导，促使炎症因子的产生，如 TNFα、IL-1β、IL-6 等。对于受感染的机体来说，一方面，炎症因子可以诱导急性炎症的发生，促使免疫细胞在感染部位聚集，从体内清除病原体。另一方面， LPS 过度的刺激会促使

信号转导,炎症,巨噬细胞

图 1-3 巨噬细胞被激活时所涉及的炎症信号转导[43]ig. 1-3 Inflammatory signal transduction involved in activation of macrophaκB 信号通路核转录调节因子（nuclear factor-κB，NF-κB）是录因子家族，通过控制基因网络表达在心血管生长、应激反应用。虽然 NF-κB 亚基广泛表达，但它们的作用是以细胞类型节的，从而可以产生不同的效应[44]。例如，紫外、细胞因子、壁的产物、血管升压类药物、病毒感染和DNA损伤都能够激活κB 的激活被认为是由两个不同的途径控制的，称为经典‖和 ]。(1)经典途径。正常情况下，Rel A(p65)·NF-κB 通过与 IκBα失去与 DNA 结合和核转位能力的复合体，游离在细胞质中[4，TNF-α，IL-1）与膜受体结合后激活 IKK 复合体（包括 IKNEMO，IKAP，FIP）使 IKKα 和 β 磷酸化，重新游离到细胞

【参考文献】