基于代谢组学和主成分体内动力学的苍术炮制机理研究

发布时间：2020-07-19 00:44

【摘要】：目的:本研究拟采用代谢组学的方法,在明确与脾虚相关的差异代谢物基础上,研究麸炒前后的苍术对脾虚大鼠血清和尿液差异代谢物组成和水平的不同调节作用,明确苍术麸炒后健脾作用增强的作用机理和潜在生物标志物水平差异;并通过对麸炒前后的苍术中主要成分进行药代动力学和排泄动力学方面的研究,明确其异同,从主要成分体内代谢消除的角度解释苍术麸炒后的增效作用;通过代谢组学以及结合药代动力学和排泄动力学的研究,进而阐释苍术炮制机理。材料与方法:1.材料苍术购于北京同仁堂药房沈阳分店,经辽宁中医药大学鉴定教研室李峰教授鉴定为茅苍术Atractylodes Lancea(Thunb.)DC.的干燥根茎,苍术麸炒方法参考《中国药典》(2015年版)饮片的炮制方法。番泻叶购于成大方圆连锁药店沈阳店。吗丁啉购于西安杨森制药有限公司。参苓白术散购于山西华康药业股份有限公司。ELISA试剂盒购于上海联硕生物科技有限公司。TRIzol购于德州曼巴商贸有限公司。反转录试剂盒购于Takara公司。分析甲醇、乙腈均购于德国Merck公司。甲酸购于上海CNW公司。白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、苍术苷A和对乙酰氨基酚均购于江苏永健医疗科技有限公司,纯度均大于98%。2.方法2.1苍术麸炒前后干预脾虚大鼠的药效学研究SPF级SD大鼠120只,随机分10组(n=12)即:空白对照组、模型组、参苓白术散组、吗丁啉组、麸炒苍术高剂量组(麸炒高组)、麸炒苍术中剂量组(麸炒中组)、麸炒苍术低剂量组(麸炒低组)、生苍术高剂量组(生高组)、生苍术中剂量组(生中组)和生苍术低剂量组(生低组)。模型组大鼠采用饮食不节、疲劳过度及苦寒泻下复合法造成大鼠脾虚模型。将生苍术及麸炒苍术分别制备成高、中、低3个浓度的溶液,共给药10 d。采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定大鼠血清中与消化酶活力变化有关的胰蛋白酶和淀粉酶的含量、与胃肠激素水平有关的血管活性肠肽、生长抑素、胃泌素和P物质的含量、与膜蛋白功能有关的NA~+-K~+-ATP酶的含量、与线粒体酶活力有关的琥珀酸脱氢酶的含量。采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法测定大鼠小肠中与胃肠激素水平有关的血管活性肠肽、生长抑素、胃泌素和P物质的相对表达量。2.2苍术麸炒前后干预脾虚大鼠的代谢组学研究收集上述空白对照组(n=10)、模型组(n=10)、生苍术组(n=10)和麸炒苍术组(n=10)的血清和尿液,采用UPLC-Q/TOF-MS进样分析。先将色谱条件优化,确定离子源类型,利用MassLynx 4.1软件进行色谱峰识别以及峰匹配,然后将积分数据进行归一化后应用SIMCA_P软件进行多维统计分析。采用无监督模式识别(主成分分析PCA)及有监督模式识别(偏最小二乘-判别分析PLS-DA、正交偏最小二乘-判别分析OPLS-DA)进行分析,利用得分图、OPLS-DA载荷图、VIP值(VIP1)找到差异变量,再用t-test对筛选的差异变量进行验证,只有p值小于0.05的差异变量才被认为是差异代谢物。以这些差异变量为依据,结合参考文献以及METLIN、HMDB和KEGG等数据库信息,进行差异代谢物的鉴定。先鉴定出空白对照组与模型组之间的差异代谢物,并根据这些差异代谢物进行代谢通路归属分析,再鉴定出经生苍术及麸炒苍术分别干预后所调节的潜在生物标志物,并根据这些潜在生物标志物进行代谢通路归属分析。2.3苍术麸炒前后主要成分的药代动力学研究将大鼠随机分为生苍术组(n=6)和麸炒苍术组(n=6)。大鼠灌胃给予生苍术和麸炒苍术提取物后,分别于给药后0.083、0.016、0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h进行眼眶取血,制备血浆样品,用甲醇沉蛋白后进行分析,以对乙酰氨基酚为内标。采用UPLC-MS/MS检测技术,以0.1%甲酸水-乙腈溶液作为流动相梯度洗脱,流速0.3 mL/min,色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C_(18)(1.7μm,2.1×100 mm),柱温40℃,电喷雾离子源(ESI~+),多反应监测(MRM)模式进行检测。给大鼠分别灌胃生苍术和麸炒苍术提取物,采用上述方法检测大鼠血浆中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术苷A的血药浓度。数据经DAS3.2.8软件处理,计算血浆中主要成分的药代动力学参数(达峰时间、达峰浓度、半衰期等),绘制药时曲线。2.4苍术麸炒前后主要成分的排泄动力学研究大鼠随机分为生苍术组(n=6)和麸炒苍术组(n=6)。大鼠灌胃给予生苍术和麸炒苍术提取物后,分别于给药后0、3、6、9、12、24、36、48、60、72 h收集大鼠尿液,制备尿液样品,用甲醇沉蛋白后进行分析,以对乙酰氨基酚为内标。采用UPLC-MS/MS检测技术,以0.1%甲酸水-乙腈溶液作为流动相梯度洗脱,流速0.3 mL/min,色谱柱Waters ACQUITY UPLC BEH C_(18)(1.7μm,2.1×100 mm),柱温40℃,电喷雾离子源(ESI~+),多反应监测(MRM)模式进行检测。给大鼠分别灌胃生苍术和麸炒苍术提取物,采用上述方法检测大鼠尿液中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术苷A的浓度。数据经DAS3.2.8软件处理,测定其尿药浓度经时过程,根据排泄量-时间数据计算排泄动力学参数,绘制累计排泄-时间曲线。结果:1.苍术麸炒前后干预脾虚大鼠的药效学研究结果与空白对照组相比较,模型组胰蛋白酶、淀粉酶、血管活性肠肽、生长抑素、胃泌素、P物质、NA~+-K~+-ATP酶和琥珀酸脱氢酶的含量均显著降低(p0.05),各给药组均可使上述各指标的含量显著升高(p0.05)。经进一步对同等剂量的生苍术和麸炒苍术进行比较,发现麸炒苍术较生苍术使上述指标的含量升高更明显。与空白对照组相比较,模型组血管活性肠肽、生长抑素、胃泌素和P物质的相对表达量均显著降低(p0.05),各给药组均可使上述各指标的相对表达量显著升高(p0.05)。经进一步对同等剂量的生苍术和麸炒苍术进行比较,发现麸炒苍术较生苍术使上述指标的相对表达量升高更明显。2.苍术麸炒前后干预脾虚大鼠的代谢组学研究结果所构建的PLS-DA模型中空白对照组和模型组基本能够很好的分开,各给药组与模型组区分开且靠近空白对照组,说明各给药组的代谢物特征与模型组具有明显差异。与空白对照组相比,从模型组血清中发现D-尿胆素原等7个物质的水平均显著升高(p0.05),而L-酪氨酸等7个物质的水平均显著降低(p0.05)。推测这些物质是与脾虚相关的差异代谢物,经对差异代谢物分析发现这14个化合物分别与10条代谢通路有关。在明确与脾虚相关的差异代谢物和代谢通路的基础上,对生苍术和麸炒苍术分别干预后的大鼠血清进行研究。生苍术和麸炒苍术均可对部分潜在生物标志物具有调节作用,但只在肌苷三磷酸和白三烯C_4的调节作用上,生苍术要优于麸炒苍术。在胆红素、S-腺苷高半胱氨酸、酪胺、磷酸胆碱和S-腺苷甲硫氨酸的调节作用上,麸炒苍术要优于生苍术,从血清代谢组学角度解释了麸炒苍术药效优于生苍术的机理。所构建的PLS-DA模型中空白对照组和模型组基本能够很好的分开,各给药组与模型组区分开且靠近空白对照组,说明各给药组的代谢物特征与模型组具有明显差异。与空白对照组相比,从模型组尿液中发现L-脯氨酸等10个物质的水平均显著升高(p0.05);而半胱氨酸等16个物质的水平均显著降低(p0.05)。推测这些物质是与脾虚相关的差异代谢物,经对差异代谢物分析发现这26个化合物分别与16条代谢通路有关。在明确与脾虚相关的差异代谢物和代谢通路的基础上,对生苍术和麸炒苍术分别干预后的大鼠尿液进行研究。生苍术和麸炒苍术均可对部分潜在生物标志物具有调节作用,但只在胞磷胆碱和半胱氨酸的调节作用上,生苍术要优于麸炒苍术。在L-岩藻糖-1-磷酸盐、精氨基琥珀酸和L-胱氨酸的调节作用上,麸炒苍术要优于生苍术,从尿液代谢组学角度解释了麸炒苍术药效优于生苍术的机理。3.苍术麸炒前后主要成分的药代动力学研究结果白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术苷A在测定浓度范围内线性关系良好(R~2≥0.9919),精密度和准确度均在±15%内,符合《中国药典》(2015年版)收载的生物样品定量分析方法验证指导原则的要求。说明本法专属性强、灵敏度高、精密度好,可用于大鼠灌胃生苍术和麸炒苍术提取物后血浆中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术苷A的药代动力学研究。和生苍术组相比,麸炒苍术组中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术苷A的C_(max)均显著升高(p0.05);麸炒苍术组中白术内酯Ⅲ的t_((1/2))显著缩短(p0.05);麸炒苍术组中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和白术内酯Ⅲ的AUC_((0-t))均显著增加(p0.05)。药代动力学参数结果表明麸炒苍术血浆中4种成分吸收效果优于生苍术。4.苍术麸炒前后主要成分的排泄动力学研究结果白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术苷A在测定浓度范围内线性关系良好(R~2≥0.9949),精密度和准确度均在±15%内,符合《中国药典》(2015年版)收载的生物样品定量分析方法验证指导原则的要求。说明本法专属性强、灵敏度高、精密度好,可用于大鼠灌胃生苍术和麸炒苍术提取物后尿液中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术苷A的排泄动力学研究。和生苍术组相比,麸炒苍术组中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ和苍术苷A的尿排总量均显著升高(p0.05);麸炒苍术组中白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术苷A的总尿排率均显著升高(p0.05)。排泄动力学参数结果显示麸炒苍术尿液中4种成分排泄率高于生苍术。结论:1.生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠均有治疗作用,且麸炒苍术健脾作用优于生苍术。苍术麸炒后健脾作用增强可归因于对消化吸收功能中消化酶活力的调节能力及胃肠激素水平的调节能力增强;以及对细胞膜结构和功能中膜蛋白的调节能力及物质能量代谢中线粒体酶活性的调节能力增强。2.L-酪氨酸、D-尿胆素原、胆红素等物质可能为与脾虚相关的差异代谢物,氨酰-tRNA生物合成、丙氨酸,天门冬氨酸和谷氨酸代谢、酪氨酸代谢等通路可能为与脾虚相关的代谢通路。生苍术和麸炒苍术对脾虚大鼠潜在生物标志物均具有调节作用,但麸炒苍术对潜在生物标志物的调节作用要优于生苍术。3.明确了麸炒可促进苍术中主要成分白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术苷A的吸收。4.明确了麸炒可促进苍术中主要成分白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ和苍术苷A的排泄。综合以上结论,本文分别从代谢组学、药代动力学及排泄动力学角度阐明了苍术炮制机理。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R283
【图文】：

各组大鼠血清中TRY的含量（ng/mL）

基于代谢组学和主成分体内动力学的苍术炮制机理研究

各组大鼠血清中AMS的含量（μmoL/L）

基于代谢组学和主成分体内动力学的苍术炮制机理研究

各组大鼠血清中VIP的含量（pg/mL）

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